双选择体的涂覆量对手性固定相分离特性的影响

刘建德， 徐小琴， 陈 伟， 柏正武

(武汉工程大学化学与环境工程学院,湖北武汉 430073)

手性化合物的制备、分离与检测对于生命科学和制药工业具有重要的意义[1，2]。目前，以手性固定相(Chiral Stationary Phase，CSP)为基础的高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是对映体分离和检测的最重要方法[3]，多糖类手性固定相(特别是纤维素和直链淀粉类手性固定相)因其优越的分离性能在HPLC对映体拆分中得到最广泛的应用[4，5]。为了扩大手性柱的应用范围，一些文献报道了双选择体(Biselector)CSP的制备及其分离性能[6 - 9]。虽然这些双选择体CSP的分离能力一般介于两个相应单选择体固定相的之间，但扩大了固定相的手性识别范围。对于多糖衍生物类CSP来说，多糖衍生物在固定相上的涂覆量一般不超过20%(wt%)。如果增加两种多糖衍生物的共混物在固定相上的涂覆量，能否提高双选择体CSP的分离性能，则未见文献报道。

本文分别将纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)，以及淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和淀粉-三(4-甲基苯甲酸酯)进行共混，制备了两种不同涂覆量的双选择体CSP，测试了它们的手性分离性能，并对其分离特性进行了讨论。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)，包括四元泵、自动进样器、柱温箱及二极管阵列检测器(DAD)；Nicolet 5DX FT-IR型红外光谱仪(美国，尼高力公司)；Vario EL Ⅲ CHNOS型元素分析仪(德国，Elementar公司)；Alltech 1666型色谱柱填充泵(美国，Alltech公司)；250×4.6 mm不锈钢空色谱柱(美国，热电公司)。

微晶纤维素(美国Sigma-Aldrich公司)；淀粉(日本Acros Organics公司)；硅胶，球形平均粒径7 μm，孔径1 000 Å(日本Daiso Co.，Ltd.)；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(北京百灵威化学技术有限公司)；3,5-二甲基苯基异氰酸酯(德州绿邦化工有限公司)；4-甲基苯甲酰氯(江苏磐希化工有限公司)；吡啶：依次用KOH和CaH2回流干燥，重蒸。其他用于制备CSP的试剂均为分析纯。

1.2 多糖衍生物的制备

参照文献中的方法[9]，制备纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)，淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和淀粉-三(4-甲基苯甲酸酯)。这些衍生物的红外光谱和元素分析结果与其结构相符合。

1.3 制备手性固定相

3-氨基丙基硅胶由3-氨基丙基三乙氧基硅烷与硅胶于95 ℃下在甲苯中反应24 h制得，所得氨丙基硅胶用丙酮抽提12 h[10]。将0.28 g(0.54 mmol葡萄糖重复单元，下同)纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)和0.33 g(0.54 mmol)纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)置于30 mL DMF中，搅拌使其完全溶解，用蒸除溶剂法将其涂覆于3.00 g 3-氨基丙基硅胶表面，制得CSP1，涂覆量为17%。用同样的方法，将纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)和纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)以25%的涂覆量涂覆于3-氨基丙基硅胶表面制得CSP2；以淀粉-三(4-甲基苯甲酸酯)及淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)代替两种纤维素的衍生物，分别制得CSP3和CSP4，其涂覆量分别为17%和25%。

实验中的手性样品的结构见图1。

图1 手性样品的结构式

1.4 色谱条件

用匀浆法装填色谱柱。以联苯为分析物，正己烷-异丙醇(90∶10，V/V)为流动相，检测柱效；以1,3,5-三叔丁基苯为分析物，测死时间(to)。手性样品溶液均用乙醇配制(1 mg/mL)，并经0.2 μm滤膜过滤，进样体积为10L。在所有检测中，流动相的流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃。

2 结果与讨论

2.1 固定相手性分离性能的比较

CSP 1～4的柱效分别为27 400、20 000、30 800和34 700N/m。用35种结构不同的手性样品(图1)，对所制备固定相的手性分离性能进行了评价。以最大分离度表示固定相对手性化合物的分离性能，表1所列出的是手性样品在各固定相上与最大分离度相对应的结果。由表1可知，CSP1和CSP2都识别了29种手性样品，手性识别能力相当。CSP1和CSP2分别基线分离了18和16种手性化合物，大多数手性样品在CSP1上比在CSP2上的分离度要大一些，只有10种手性样品呈现相反的趋势。所以从整体看，CSP1的分离性能比CSP2要强一些。所以增加两种纤维素共混物的涂覆量，并未使相应固定相的手性分离性能得以提高。CSP3和CSP4分别识别了26和28种手性样品，其中有16和19种化合物分别达到基线分离。所以CSP4比CSP3有更强的手性识别能力和更好的分离性能。对于两种以共混淀粉衍生物为手性选择体的固定相来说，增加选择体的涂覆量，固定相的手性识别能力和分离性能都得到一定程度的提高。综上所述，在选择体的涂覆量对固定相的手性识别及分离性能影响方面，纤维素衍生物双选择体固定相和淀粉衍生物双选择体固定相呈现相反的变化趋势。其原因可能是纤维素与淀粉衍生物的高级结构的不同，导致双选择体固定相存在不同的手性凹槽，从而出现不同的手性分离性能[10]。

2.2 流动相的组成对手性识别的影响

在含混合醇(同体积乙醇和甲醇混合物)流动相中，分别有17、17和14种手性化合物的对映体在CSP1、CSP3和CSP4上分离度最大，明显多于在含异丙醇及含乙醇的流动相中有最大分离度的对映体，所以含混合醇流动相有利于这三种固定相的手性识别及分离。而CSP2例外，该固定相在上述三种流动相中有最大分离度的对映体分别为10、10和9种，即CSP2在这些流动相中的手性识别能力几乎相当。

表1 纤维素及淀粉衍生物固定相的分离性能比较

(续表1)

Mobile phase:n-hexane/isopropanol(A1100/0,A295/5,A390/10,A480/20,A570/30,v/v);n-hexane/ethanol(B197/3,B295/5,B390/10,B470/30,B550/50,V/V);n-hexane/[ethanol/methanol(50/50,V/V),C198/2,C295/5,C390/10,C470/30,C550/50,V/V].

在这三种流动相中，与CSP1相比CSP2的手性分离性能并没有提高，因此在含其它不同结构醇的流动相中测试了CSP2的分离性能(表2)。可以看出，以正己烷/正丁醇、正己烷/异丁醇和正己烷/叔丁醇为流动相时，手性样品在CSP2上的容量因子(k)大小顺序为：k正丁醇

表2 CSP2在含不同醇的流动相中的分离结果

Eluent:A:n-hexane/n-propanol;B:n-hexane/isopropanol;C:n-hexane/n-butanol;D:n-hexane/iso-butanol;E:n-hexane/t-butanol.

3 结论

分别将两种纤维素衍生物和两种直链淀粉衍生物进行共混，制备了涂覆量为17%和25%的双选择体固定相，并研究了流动相的组成对手性分离的影响。对于直链淀粉衍生物双选择体固定相，提高衍生物的涂覆量，能提高固定相的分离性能；对于纤维素衍生物双选择体固定相来说，提高衍生物的涂覆量，固定相的分离性能稍有降低。另外，在较高涂覆量的纤维素衍生物双选择体固定相上，手性样品在含叔丁醇、异丁醇和正丁醇流动相中的保留因子呈依次减小的趋势，一些样品的对映体在含叔丁醇或异丁醇的流动相中能被更好地分离。