乙基紫探针共振瑞利散射法测定头孢硫脒

2015-10-18向术平孙芳芳许国萍

分析科学学报 2015年4期

向术平，孙芳芳，许国萍，江虹*

(1.长江师范学院化学化工学院，重庆 408100；2.渝中区环保局，重庆 40400； 3.彭水环保局，重庆 409699)

头孢硫脒(CEFA)是我国自行研制并首先应用于临床的半合成头孢菌素。CEFA对革兰阳性菌和部分革兰阴性杆菌均有良好的抗菌活性，临床上主要用于敏感菌引起的各种感染，尤其适用于金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、表葡菌和肠球菌等革兰阳性球菌引起的各种中重度感染的治疗。由于抗生素的广泛使用，细菌与药物多次反复接触后敏感性降低，许多常用头孢菌素类药物疗效减弱，而CEFA因其自身独特的性质在临床上倍受重视。目前，测定CEFA的方法主要是高效液相色谱法[1 - 4]，也有荧光光度法[5]的报道。高效液相色谱法虽然灵敏度高，但仪器较昂贵不易普及。

本工作在稀NaOH 溶液中，以乙基紫(EV)作探针，用共振瑞利散射(RRS)技术，研究并建立了测定痕量CEFA的新方法，迄今未见文献报道。方法用于实际药物及人血液中CEFA含量的测定，样品加标回收率为 99.5%～101.8%，相对标准偏差(RSD)小于1.2%，结果满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-2500型荧光分光光度计(日本，日立公司)，测定狭缝2.5 nm；pHS-3C型精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

头孢硫脒标准(CEFA，重庆药检所)溶液：储备液浓度47.26 mg/L，冰箱4 ℃保存，用时稀释10倍。乙基紫(EV，上海化学试剂公司分装厂)溶液：1.0×10-4mol/L。NaOH溶液：0.20 mol/L。Tris-HCl缓冲溶液：0.1 mol/L HCl和0.2 mol/L Tris混合，用酸度计调节，配成pH=3.0～9.8的系列缓冲溶液。所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

于10 mL具塞比色管中，加入一定量的4.73 mg/L CEFA标准溶液，1.0 mL 0.20 mol/L NaOH 溶液和 3.0 mL 1.0×10-4mol/L EV溶液，用二次蒸馏水稀至刻度，摇匀，15 min 后，以λex=λem=220 nm 在荧光分光光度计上进行同步扫描，得RRS光谱，在最大共振散射波长341 nm 处测定体系的RRS强度IRRS和试剂空白的散射强度I0，计算△IRRS=IRRS-I0。

2 结果与讨论

2.1 EV-CEFA的共振瑞利散射光谱

图1 乙基紫与头孢硫脒的共振瑞利散射光谱

按实验方法扫描CEFA标准溶液、EV溶液及CEFA-EV溶液。从图1可知，CEFA和EV自身的RRS均十分微弱(图中曲线1和2)，当在CEFA 的稀NaOH 溶液中加入EV后，CEFA结构中的羧酸根离子则与EV以静电引力和疏水作用力结合生成离子缔合物，使体系的RRS强度显著增强，其最大共振散射峰位于341 nm，在此波长下，CEFA在一定浓度范围内，随着其浓度的增加，体系的RRS强度呈线性下降(图中曲线4～7)，故可用于CEFA 的定量分析。

2.2 反应介质及用量的选择

考察了pH=3.0～9.8 的Tris-HCl缓冲溶液和0.20 mol/L NaOH 溶液对CEFA-EV体系△IRRS的影响。结果表明：用0.20 mol/L NaOH 溶液1.0 mL 有较好的效果，体系的灵敏度较高。实验选用1.0 mL 0.20 mol/L NaOH溶液。

2.3 EV溶液浓度的选择

考察了不同浓度的 EV 溶液对CEFA-EV体系△IRRS的影响。结果表明：EV浓度在(2.0～3.0)×10-5mol/L 时，体系的△IRRS较大，实验用1.0×104mol/L EV 溶液3.0 mL。

2.4 试剂加入顺序的选择

考察了EV、CEFA 和 NaOH 溶液在不同加入顺序时对体系△IRRS的影响。结果表明：以实验方法的加入顺序为最佳。

2.5 反应时间

在优化条件下，考察了不同反应时间对体系 △IRRS的影响，结果表明：缔合物在 15 min内即可形成，至少稳定1 h。实验选在 15 min后测定。

2.6 标准曲线及检出限

按实验方法配制标准系列溶液并在荧光光度计上扫描RRS光谱。在测定波长341 nm 下作 △IRRS-c标准曲线。线性回归方程为:△IRRS=-524.1-1964c(c:mg/L)，相关系数r=0.9988，线性范围为0.094～0.70 mg/L，检出限(3Sb/K)为0.075 mg/L。

2.7 方法的选择性

在选定条件下，考察了一些常见物质对测定 0.473 mg/L CEFA 的影响。结果表明，相对误差不大于±5% 时，以下共存物质(倍量)不干扰测定：葡萄糖、麦芽糖、D-果糖、D-木糖、L-赖氨酸、L-白氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、H2C2O4(200)；甘氨酸、L-谷氨酸、L-丙氨酸、柠檬酸三钠、NaCl、KCl(100)；L-亮氨酸、氨基乙酸、D-甘露糖(80)；Na2SO4、K2SO4、Na2S2O3、KNO3、NH4NO3、Mg(NO3)2、Ba(NO3)2、Pb(NO3)2、Sr(NO3)2(50)；NaI、MnSO4、MgSO4、Fe2(SO4)3、CuCl2、CaCl2、SrCl2(20)；DL-苹果酸、尿素(10)。可见，方法具有良好的选择性。

2.8 样品分析

2.8.1药物分析取重庆市庆余堂制药有限公司注射用CEFA 1支，将内容物溶解后移入1 000 mL 容量瓶中，用水稀至刻度，摇匀。取该液0.50 mL 于100 mL 容量瓶中，用水稀至刻度，摇匀，即为CEFA 待测液。取待测液1.0 mL于10 mL 比色管中，按实验方法加入 NaOH 溶液和EV 溶液，并用水稀至刻度，再按实验方法测定样液中 CEFA 的含量，平行6份，同时作加标回收试验(n=6)，结果见表1。

2.8.2血液分析取人体血液样品(重庆涪陵中心医院提供)，以4 000 r/min 离心20 min，取上清液1.0 mL，加入 2.0 mL 甲醇，摇匀，离心分离 10 min，将离心液定容至25.0 mL。取该定容液 1.0 mL，用水稀释至100 mL，即得待测液。取待测液1.0 mL，按实验方法加入 NaOH溶液和EV溶液，测定血液样品中CEFA含量，平行测定6份，同时做加标回收试验，结果见表1。