在线固相微萃取在烟用料液的指纹图谱中的应用

魏维伟, 杨华武, 孔 波

(湖南中烟工业有限责任公司技术研发中心，湖南长沙 410014)

烟用料液和烟用表香香精一样，在改善卷烟吸味方面有着重要的作用。表香香精的指纹图谱相对容易获得，且其色谱有较高的信息量和较好的重现性。而烟用料液的指纹图谱则因其水溶性成分较难提取，造成指纹图谱信息量有限、特征反映不显著、重现性差。因此，烟用料液的指纹图谱技术亟待改进以正确表征其质量状态或质量特点。目前，烟用料液分析主要集中在非挥发的成分分析[1,2]，如糖类、氨基酸、类胡萝卜素等的测定[3]。烟用料液的指纹图谱方法主要是液相色谱法和有机溶剂液-液萃取的气相色谱-质谱法(GC-MS)。液相色谱法存在无通用检测器、检测灵敏度低、分离效果低的缺点。有机溶剂液-液萃取的GC-MS则因有机溶剂为非极性或弱极性，仅能萃取烟用料液中的非极性和弱极性组分、无法有效萃取烟用料液中的水溶性成分，所以其指纹图谱信息量有限、水溶性成分特征反映不显著、重现性差。用弱极性的二氯甲烷、乙醚等替代非极性的正己烷有助于改善这些缺陷，但改善程度有限。

固相微萃取(SPME)是20世纪90年代发展起来的新型样品预处理方法[4]，具有快速、灵敏、操作简单、样品用量少等优点[5,6]，已经应用于烟用香精香料的分析检测[7 - 9]。对于SPME取样条件的研究,一般以所得色谱峰个数或色谱峰面积为指标，即用提取量作为评估萃取效率的主要依据，但这样不能表现该提取方法对不同化合物的选择性[10]。仅以峰个数和峰面积表征整个色谱图,无法得到完整信息,而且重叠峰、噪声水平等因素也会对分析结果产生较大影响。本实验以信息量[11]和重现性作为评价指标来选择适合烟用料液的提取方案，建立并优化了烟用料液的SPME-GC指纹图谱方法，结果证实其显著优于乙醚液-液萃取的GC-MS法。

1 实验部分

1.1 仪器、装置与材料

Aglient 7890N气相色谱仪(美国，Aglient公司)，配Agilent 5975 型质谱检测器；Milli-Q型超纯水装置(美国，Millipore公司)；GERSTEL 三合一(固相微萃取、静态顶空、溶液进样)自动进样器(德国，GERSTEL公司)；100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/PDMS)、85 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)、50 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头(美国，Supelco公司)。

烟用料液A#(湖南中烟技术研发中心提供)；蒸馏水(自制)。

1.2 GC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱为HP-5MS 毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度250 ℃，载气为高纯氦气，流速为1.0 mL/min，分流比10∶1；程序升温：初始温度为70 ℃保持2 min，以6 ℃/min升温到250 ℃,再以10 ℃/min升至280 ℃。质谱条件：电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；扫描范围35～450 amu。

1.3 实验方法

1.3.1萃取头的老化首先将不同极性的100 μm PDMS、65 μm DVB/PDMS 、85 μm CAR/PDMS，50 μm DVB/CAR/PDMS 四种固相萃取纤维头在气相色谱进样口老化。老化温度及时间如表1所示。

表1 各种萃取头老化温度及时间

1.3.2液-液萃取方式准确移取15 mL料液于50 mL锥形瓶中，加入10 mL无水乙醚、室温下摇床震荡10 min，静置15 min，待分层后取乙醚层。重复萃取3次，合并萃取液，滤液在旋转蒸发仪上浓缩至约1 mL，加入无水Na2SO4，室温下放置过夜。

1.3.3固相微萃取取0.5 g料液于20 mL的顶空瓶中，加入12 mL水，分别加入0、0.25、0.075、0.125 g的NaCl ，摇匀后放入三合一自动进样器中，分别用100 μm PDMS、85 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDM、50 μm DVB/CAR/PDM四种萃取纤维头进行固相微萃取。待萃取完成后，按1.2节进行GC-MS分析。

1.3.4正交实验设计萃取纤维头的类型[13]、萃取温度[14,15]、萃取时间、脱附时间这四个因素影响被分析物从萃取头转移至毛细管柱中是否完全，PDMS萃取纤维头对极性物质的萃取效率低于非极性物质，NaCl的加入将有利于极性物质的析出。因此,采用正交实验，选择萃取纤维头的类型、萃取温度、萃取时间、脱附时间、加入NaCl的相对百分含量这五个因素，在四个不同的水平上进行实验。制定的正交实验表见表2；实验结果见表3。同时以信息量和丙二酸二乙酯、胡椒醛、绿叶醇等几个峰的面积总和为指标确定较优水平。

表2 正交实验表(L54)设计表

2 结果与讨论

2.1 信息量的计算

对于连续信号,根据Shannon信息理论及不重叠的正态分布峰具有最大熵的理论基础,其信息量可由下式表达[16,17]:

(1)

其中,Px表示具有概率性质(其积分等于1)的连续色谱信号。是化学组分在分布函数中的存在概率或浓度。对于一个色谱指纹图谱,先将所得色谱进行归一化处理后,其信息量可用下式计算:

(2)

其中,Px为色谱指纹图谱中的色谱响应值,而sum(Px)表示色谱响应值Px的总和。

式2所得∮值，即为色谱指纹图谱中得到的信息量值。由此求得的色谱指纹图谱的信息量既具有信息理论基础且计算简单,无需计算各色谱峰面积,同时还考虑了色谱重叠峰的影响 。本文所有信息量的计算都是先将色谱归一化处理后按式(2)计算所得。

2.2 正交实验结果分析

从表3中极差R可以看出，各因素的重要性顺序为：A>D>E>C>B,即是萃取头的影响最大，其次是脱附时间、NaCl的百分含量、萃取温度、萃取时间。以信息量和丙二酸二乙酯、胡椒醛、绿叶醇峰面积最大为原则，确定最优的固相微萃取条件为：85 μm CAR/PDMS萃取纤维头、萃取温度为60 ℃、萃取时间为50 min、脱附时间为10 min、NaCl的百分含量为0%(即不加入NaCl)。最优水平为A3B1C3D4E1。

表3 正交实验结果分析表

2.3 样品测试和提取方法稳定性的考察

按照最佳取样条件，即85 μm CAR/PDMS萃取纤维头，萃取温度为60 ℃、萃取时间为50 min、脱附时间为10 min、不加入NaCl，对料液A#用同一时间相同方法平行试验5次考察其重现性;在相同色谱条件下对提取的样品进行测定，将得到的色谱图进行保留时间漂移校正后，以5个谱图的平均谱图为标准谱图模式，并计算各谱图与平均谱图的全谱相似度并计算其平均相关系数。按1.3.2中的方法对料液进行乙醚液-液萃取，表4中列出了固相微萃取和乙醚液-液萃取两种提取方法所得到的信息量平均相关系数及其相对标准偏差(RSD) 。从表4可以看出SPME前处理方法在连续进样时具有相对较好稳定性。虽然萃取纤维头在使用一段时间间隔内会出现固定液的流失等造成吸附能力下降、最终造成稳定性下降[10]。但是由于这个过程是一个渐进的过程，因此对于在同一时间内的连续进样具有相对较好的稳定性。乙醚液-液萃取过程中由于萃取溶剂乙醚易于挥发，并且浓缩等过程带来部分物质挥发性的流失，造成较大的实验偏差，影响此方法的稳定性。固相微萃取的过程本身包含萃取富集过程，因此不需要重复的富集浓缩等操作。

表4 料液不同提取方法得到的信息量及稳定性(n=5)

SPME相对乙醚液-液萃取可以得到较大的信息量，碳分子筛与聚二甲基硅氧烷复合的固相微萃取的萃取头普遍适用与水中有机挥发性物质的测定，因此也适用于烟用料液挥发性的组分的提取；而乙醚液-液萃取过程会有较大的溶剂峰而影响信息量的计算，两种萃取方法得到的总离子流图见图1。与NIST11标准质谱库相对照，选取正、反向匹配对均大于80%的确定为已知物，对各组分进行初步定性分析，SPME法共鉴定出34种物质，定性分析结果见表5；乙醚液-液萃取仅鉴定出21种成分，分别是：乙酸、丙二醇，一缩丙二醇、戊醛丙二醇缩醛、丙二酸二乙酯、麦芽酚、甲基环戊基烯醇酮、香兰素、吡喃酮、苯甲酸、5-羟甲基糠醛、胡椒醛、3-(2-羟苯基)丙酸甲酯、对羟基苯丙酸、对甲氧基苯乙酮、覆盆子酮、异香草醛、洋茉莉醛和丙二醇醛、十六烷酸、(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸、3,4-二甲氧基苯甲酸乙酯；SPME与用乙醚液-液萃取法相比多提取出的组分有茄酮、橙花叔醇、叶绿醇及一些醛酮及酯类化合物。这些的组分是反映烟用料液A#重要组分信息：如茄酮具有烟草本香，使烟气丰满又醇和细腻；叶绿醇在调制过程中可以转化为具有清香气息的新植二烯，其含量的高低不仅直接影响烟叶的吃味和香气,而且还影响其他致香成分的形成。

图1 乙醚液-液萃取(a)和固相微萃取(b)两种方法提取料液A#的总离子流色谱图

表5 料液A#固相微萃取GC-MS鉴定结果

(续表5)

3 结论

建立了在线固相微萃取结合气相色谱-质谱联用分析烟用料液的指纹谱图的方法，得到的优化条件为：萃取温度60 ℃、萃取时间50 min、不加入NaCl、85 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)萃取纤维头。通过对在线固相微萃取与乙醚液-液萃取两种提取方法比较，结果表明固相微萃取可以获得相对较多的信息量和相对较好的稳定性；固相微萃取在挥发性组分少含量低的烟用料液分析及其气相色谱指纹图谱的建立方面具有显著的优势。该方法可以为烟用料液招标工作及烟用料液质量控制打下基础。