蒙药玉簪花乙醇提取物体外和体内的抑菌活性研究

辛 颖， 白玉花

（内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古　通辽　028000）

蒙药玉簪花乙醇提取物体外和体内的抑菌活性研究

辛 颖， 白玉花

（内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古通辽028000）

目的 研究蒙药玉簪花乙醇提取物的体外、体内抑菌活性，为寻找新的抗菌药物提供药理学参考依据。方法

玉簪花；乙醇提取物；抑菌活性

玉簪花Hosta plantaginea是百合科玉簪属宿根的草本植物，因其酷似古代妇女发髻上的玉簪而得名，有“江南第一花”的美誉［1］。玉簪花也叫白萼花、白鹤花，主要分布于亚洲的亚热带和温带地区，原产自我国和日本，我国各地均有栽培［2-3］。玉簪始载于《本草丛新》，书中记载：玉簪辛甘而寒，捣汁服，解一切毒。玉簪花的全草均能入药，其花性凉味甘，具有微毒；叶、根入药可治疗化脓性中耳炎。玉簪花为蒙医习用传统药材，蒙古名为邦占嘎尔布、查干邦占、哈斯-哈塔胡尔-其其格等，一般在夏、秋含苞待放时采收，及时阴干，主治咽喉肿痛、声音嘶哑、肺热等症，具有清热、解毒、止咳、利咽之功效［4-6］。《蒙药正典》记载其性凉，味苦。用于治疗咽喉肿痛、肺热、毒热；《认药白晶鉴》中描述“玉簪生湿草地，花白者上品，味苦，治喉疾、解毒、清疫热”［7］；《无误蒙药鉴》亦记有“玉簪花可以清肺热、治喉疾和解毒等”［8］。百合科玉簪属植物的主要化学成分为甾体皂苷［9-10］、黄酮［11］和生物碱类［12］。目前国内外的研究主要集中在玉簪花的化学成分及其解热镇痛抗炎的药理活性方面，有关其抑菌作用的报道尚不多见。本研究拟观察玉簪花的抑菌活性，为抑菌蒙药玉簪花的开发提供实验依据。

1　材料与方法

1.1菌株、动物、主要试剂与仪器 乙型溶血性链球菌（beta hemolytic streptococcus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、变形杆菌（Proteusbacillusυulgaris）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、肠球菌（Enterococcus）和白色念球菌（Candida albicans）由内蒙古民族大学医学院微生物实验室提供。昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量18～24 g，由吉林大学实验动物饲养中心提供，许可证号：SCXK（吉）2008-0005。玉簪花购自通辽蒙药厂。青霉素、链霉素购自上海生工。LB细菌培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，琼脂2%，调pH为7.4～7.6，实验用水为蒸馏水。双目生物显微镜（北京上光仪器有限公司，XSP-2CA），电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，DHP9012）；电子天平（北京仪特诺电子科技有限公司，DE-120 W）；电热恒温鼓风干燥箱（上海合恒仪器设备有限公司，DHG-9023A精密型）；恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司，HZQ/THZ）；旋转蒸发仪（上海互佳仪器设备有限公司，RE-301）；智能电热套（上海越众仪器设备有限公司，ZNHW）；高压灭菌锅（威海新月化玻仪器设备有限公司，YXQ-LS-30SII）；双人单面超净工作台（苏州江东精密仪器有限公司，SW-CJ-2FB）。

1.2制备玉簪花乙醇提取物 取玉簪花药材500 g，以95%乙醇提取2次，每次4 h，合并提取液并浓缩，得95%乙醇提取物，其提取得率为14.25%。过滤除菌后分别配制成含生药0.01～10.00 g/mL的药液备用。

1.3玉簪花乙醇提取物体外抑菌实验

1.3.1沟槽法测定玉簪花乙醇提取物抑菌活性 菌悬液的制备：将8种菌从冰箱取出后，在LB琼脂培养基上活化，再分别挑取单菌落于液体培养基中振荡培养18 h，4 000 r/min离心10 min，用PBS洗一遍，再用PBS将菌悬液吸光度调至0.5左右，稀释100倍（约含菌106cfu/mL）备用。实验分为空白对照组（Ⅰ组，蒸馏水）、青霉素对照组（Ⅱ组，2 g/L）、链霉素对照组（Ⅲ组，2 g/L）及玉簪花乙醇提取物不同质量浓度组（0.01、0.10、1.00和10.00 g/mL，Ⅳ～Ⅶ组）。在固体平板培养基上，用无菌刀片沿直径挖一细直的沟槽，在沟槽中分别加入Ⅰ-Ⅶ组备用药物，然后在沟槽两侧用接种环分别划线接种浓度为106cfu/mL的8种菌液，然后将固体平板置于37℃培养箱，24 h后观察沟槽两侧细菌生长状况。如果沟槽与细菌划线接种交界处没有出现细菌生长现象，则说明玉簪花乙醇提取物对该细菌有抑制作用，抑菌实验结果判定为阳性（+）；若交界处出现细菌生长现象，则说明抑菌实验结果为阴性（-）。

1.3.2药物琼脂培养基法测定玉簪花乙醇提取物抑菌活性

分别取琼脂培养基27 mL装入50 mL锥形瓶中，置50℃水浴备用，将玉簪花乙醇提取物的不同质量浓度组（0.01、0.10、1.00和10.00 g/m L，Ⅳ～Ⅶ组）加入到琼脂培养基中，加入1.5 mL兔血，混匀后倒入平皿冷却。用移液枪吸入5μL菌液到培养皿上涂成直径为1 cm的圆后，置入37℃培养箱培养，24 h后观察细菌生长情况。如没有出现细菌生长现象，则说明玉簪花乙醇提取物对该细菌有抑制作用，抑菌实验结果判定为阳性（+）；若出现细菌生长现象，则说明抑菌实验结果为阴性（-）。

1.4玉簪花乙醇提取物体内抑菌实验

1.4.1胃膜素混悬液的配置 称取胃膜素20 g，放于研钵内，加少量生理盐水研磨，加至400 mL，加压灭菌10 min即可。临用时调整其pH至7.0。

1.4.2菌液的制备 将菌液37℃培养16～18 h后，用无菌生理盐水10倍比例稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同浓度菌液，比浊法测定活菌数，再吸取稀释好的不同浓度的菌液1 m L分别放于灭菌试管内，分别加入5%胃膜素混悬液9 mL，即做成浓度为1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1× 103cfu/mL的细菌悬液备用。

1.4.3预实验 将不同浓度的菌悬液分别注射于小鼠体内，每浓度组10只，腹腔注射乙型溶血性链球菌，0.5 mL/只，感染，腹腔注射金黄色葡萄球菌，0.5 mL/只，感染，观察动物4 d内的死亡情况，选用引起小鼠80%～100%死亡的菌液浓度作为本研究中体内抑菌实验的用量。

1.4.4玉簪花乙醇提取物体内抑制乙型链球菌和金黄色葡萄球菌的实验 取昆明种小鼠108只，雌雄各半，按体质量随机分为空白对照组、模型组、玉簪花乙醇提取物低、中、高剂量组（0.02、0.20、2.00 g/kg）。每组12只，玉簪花3个剂量组连续灌胃3 d后，第4天给药30 min后除了空白组以外其他组根据菌株毒力预试实验情况选取LD80-90（1×108）的细菌量感染小鼠，乙型溶血性链球菌腹腔注射感染，每只0.5 mL，金黄色葡萄球菌每只0.5 mL，腹腔注射。观察小鼠一般状况，观察并统计4 d内各组小鼠的死亡率。当有小鼠死亡时，无菌操作分别取出小鼠肾脏，称定质量研磨，用无菌生理盐水配制成0.1 g/mL的组织悬液，取0.2 mL均匀涂布琼脂平板，放置于37℃恒温培养箱中培养24 h，观察计数菌落。挑取培养出的菌落，用细菌测定仪对其进行鉴定。至感染第9天，非用药组小鼠全部死亡，同时处死其余各组剩余小鼠，以同样的方法做肾脏组织悬液培养。若无菌落生长而给药剂量较大应考虑动物可能死于药物毒性，存活动物心血标本培养应无菌。

1.5统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。各组间的死亡率比较采取卡方检验进行统计学分析。

2　结果

2.1玉簪花乙醇提取物体外抑菌实验

2.1.1沟槽法实验结果 空白对照组对8种致病菌均无抑制作用，青霉素对照组对白色念珠菌、肺炎克雷伯菌、乙型溶血性链球菌具有抑制作用。链霉素对照组对大肠杆菌、白色念珠菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌具有抑制作用。不同质量浓度的玉簪花乙醇提取物的抑菌效果不同，当玉簪花质量浓度为10.00 g/mL和1.00 g/mL时对乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。当玉簪花质量浓度降至0.10 g/mL和0.01 g/mL时对8种致病菌均无抑制作用。结果见表1。

表1　沟槽法检测玉簪花乙醇提取物抑菌活性

2.1.2药物琼脂培养基法实验结果 与空白对照组比较，青霉素对照组对白色念珠菌、肺炎克雷伯菌、乙型溶血性链球菌具有抑制作用；链霉素对照组对大肠杆菌、白色念珠菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌具有抑制作用；玉簪花质量浓度为10.00 g/mL、1.00 g/mL和0.10 g/mL时对乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。结果见表2。

表2　药物琼脂培养基法检测玉簪花乙醇提取物抑菌活性

2.2玉簪花乙醇提取物体内抑菌实验 预实验结果显示对照组无动物死亡，1×108cfu/mL的致死率为83.33%，确定为本次实验感染的菌液浓度。与空白对照组比较，模型对照组的动物死亡率为91.7%和41.7%（P＜0.01），表明造模成功。与模型对照组比较，玉簪花的中、高剂量组小鼠的死亡率明显降低（P＜0.05，P＜0.01），且平均存活天数增加。提示玉簪花乙醇提取物对乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌致小鼠感染死亡具有明显的保护作用，显示了玉簪花具有一定的体内抗菌作用。培养24 h后自然死亡小鼠都有菌落生长，第9天处死小鼠空白组无菌落生长，其他组较少有生长。鉴定结果为乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌。结果见表3。

表3　玉簪花乙醇提取物体内抑菌活性实验

3　讨论

玉簪花的全草均可入药，根入药可以起到清热消肿、解毒止痛的作用，叶入药具有消肿解毒的功效，而花入药则能利湿、调经止带。中药记载用玉簪花的鳞茎可以清热解毒、祛风除湿、镇痛止血、消肿散瘀，临床上用于治疗风湿疼痛和关节肿大等症。作为内蒙古地区蒙医常用药材的玉簪花，在《蒙药正典》中记载其性凉、味苦，用于治疗咽喉肿痛、肺热和毒热。蒙医主要用玉簪花来治疗急、慢性咽炎。

将玉簪花配制成醋治疗耕牛的脱节烂头病，其治疗的有效率可达96.4%［13］。玉簪花根在治疗骨质增生方面也有很好的治疗效果［14］。有研究发现玉簪花的乙醇提取物具有明显的镇痛作用，可以在小鼠的热板实验中降低疼痛阈值；在醋酸扭体实验中减少扭体次数［15］。玉簪花的化学成分中含有甾体类化合物，其具有一定的抗癌活性，对不同肿瘤细胞具有细胞毒选择性［16］。玉簪全草中的生物碱对烟草花叶病毒、乙酰胆碱酯酶具有明显抑制作用［17］。叶晓川等研究结果显示，玉簪花的正丁醇萃取物对红色毛癣菌和白色念球菌具有明显的抑制作用；玉簪花的乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用明显，说明玉簪花具有一定的抑菌活性，推测其主要抑菌成分可能为黄酮类化合物和皂苷［18］。

目前有关玉簪花抑制细菌作用方面的研究很少，尤其是针对致病菌的报道更为少见。本研究选取了临床常见的8种致病菌，观察玉簪花乙醇提取物对8种致病菌的抑制作用，为将其开发为抗菌药物提供实验依据。本研究中沟槽法体外抑菌实验结果显示：玉簪花乙醇提取物对乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制作用。药物琼脂培养基法对玉簪花乙醇提取物抑制8种致病菌的实验结果发现：玉簪花乙醇提取物在体外对乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用，并且其抑菌作用随浓度增加而增强，且玉簪花对青霉素、链霉素双重耐药的金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用。本研究的体内抑菌实验发现：玉簪花乙醇提取物灌胃给药剂量高于0.20 g/kg时具有明显的体内抑菌活性，且抑菌作用随着浓度增加呈现增强的趋势。有报道显示玉簪花的主要化学成分为黄酮、甾体皂苷和生物碱类，究竟哪类成分是其抑菌成分，仍需要进一步探索。该研究可以为天然绿色资源植物玉簪花的开发、充分合理利用提供有价值的理论基础和参考依据。

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R284.2

B

1001-1528（2015）03-0653-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.044

2014-05-23

内蒙古自然科学基金资助项目（2011BS1204）

辛 颖（1980—），女，博士，副教授，从事蒙药药理学研究。Tel：（0475）8314894，E-mail：xinying20081115@163.com

体外实验分为空白对照组（Ⅰ组）、青霉素对照组（Ⅱ组）、链霉素对照组（Ⅲ组）和玉簪花乙醇提取物的不同质量浓度组（0.01、0.10、1.00、10.00 g/mL）组（Ⅳ～Ⅶ组）。醇提法制备玉簪花的乙醇提取物，沟槽法和含药琼脂培养基法检测玉簪花乙醇提取物对乙型溶血性链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、白色念球菌的体外抑菌活性。体内实验分为空白对照组、模型组和玉簪花低、中、高剂量组（0.02、0.20、2.00 g/kg），以乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌种，小鼠灌胃给予玉簪花乙醇提取物7 d后，腹腔注射乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌，通过观察小鼠死亡率衡量玉簪花乙醇提取物的体内抗菌活性。结果 体外抑菌试验显示，当玉簪花质量浓度高于1.00 g/mL，玉簪花乙醇提取物对乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用。在体内抑菌实验中，玉簪花乙醇提取物中、高剂量具有抑制乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌的作用，与空白对照组的小鼠死亡率相比，小鼠死亡率明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。结论 蒙药玉簪花乙醇提取物中含有抑菌的活性成分。