富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠肿瘤微环境影响的实验研究

高华武， 田丽娜， 龙子江*， 刘金林， 任振兴， 陆松侠

（1.安徽中医药大学，安徽　合肥　230038；2.安庆医药高等专科学校，安徽　安庆　246052）

［科研报道］

富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠肿瘤微环境影响的实验研究

高华武1， 田丽娜1， 龙子江1*， 刘金林2， 任振兴1， 陆松侠1

（1.安徽中医药大学，安徽合肥230038；2.安庆医药高等专科学校，安徽安庆246052）

目的 研究富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用及肿瘤微环境的影响。方法 S180荷瘤模型小鼠随机分为模型组，环磷酰胺阳性对照组（60 mg/kg），黄芪组（3.9 g/kg），紫云英组（3.9 g/kg），富硒芪云水提物低（1.95 g/kg）、中（3.9 g/kg）、高（7.8 g/kg）剂量组，另取正常小鼠为正常对照组。连续灌胃给药，持续治疗10 d后，第11天剥取瘤组织称定质量，计算抑瘤率。取血检测各组荷瘤小鼠血清硒结合蛋白1（SBP1）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX l）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、活性氧（ROS）。结果 富硒芪云水提物1.95、3.9、7.8 g/kg抑瘤率分别为13.64%、44.92%、38.70%；富硒芪云水提物各剂量组能明显增加血清SBP1蛋白表达，提高GPX 1活性，提高AMPK水平、减少ROS含有量（P＜0.05），与模型组比较，1.95 g/kg、3.9 g/kg剂量组有显著性差异（P＜0.05）；与黄芪组比较，3.9 g/kg剂量组有显著性差异（P＜0.05）。结论 富硒芪云水提物能抑制S180肿瘤细胞的增长，其机制可能为升高肿瘤细胞中硒水平，影响肿瘤微环境而发挥抗肿瘤作用。

富硒芪云水提物；荷瘤小鼠；氧化；硒；微环境

中药黄芪为扶正益气中药，具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌等功效，临床常用于抗肿瘤［1］。紫云英，又名红花草，营养价值丰富，《全国中草药汇编》指出紫云英具有解毒止痛、清除邪毒之功效，配伍黄芪用于抗肿瘤研究，应证中医“扶正祛邪”理论［2］。流行病学研究表明许多癌症都与硒的摄入不足有关［3］，硒日补充剂量在200～400μg能降低癌症发生率［4］，我国传统中药富含天然有机硒，应用于抗肿瘤具有独特优势。研究显示黄芪、紫云英为硒富集中药［5-6］。本课题组前期采用ICP-MS检测发现，黄芪紫云英配伍水提物含硒量可高达9.346μg/g，以黄芪临床日用量30 g计算，黄芪紫云英配伍水提物含硒量为280.36μg/g，远高于《食品中硒限量标准》、《食品安全法》和《食品安全国家标准管理办法》等国家标准（规定指出，动植物产品含硒量达50～200μg/g为富硒产品）［7］。

综合黄芪紫云英扶正祛邪以及富硒特性，本实验研究富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠的抑制作用和对血清SBP1、GPX 1、AMPK和ROS的影响，探讨其对肿瘤细胞微环境的影响，为富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用及机制提供理论依据。

1　材料与方法

1.1动物与瘤株 SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，20～25 g，安徽省实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（皖）2005-001。S180鼠源性肉瘤细胞，南京中医药大学陆茵老师惠赠，本室传代保种。

1.2主要试剂及仪器 黄芪，产地内蒙古，由安徽中医药大学第一附属医院提供；紫云英，产地安徽，由药用美誉有限公司提供；注射用环磷酰胺，批号2J679A，由Baxrer Oncology GmbH公司提供。SBP1试剂盒（批号E-20634）、GPX 1试剂盒（批号E-20729）、AMPK试剂盒（批号E-26041）、ROS试剂盒（批号E-22033），均由南京建成生物工程研究所提供。

酶标仪，RT-6000，深圳雷杜生命科学股份有限公司；离心机，JW3021HR，安徽嘉文仪器装备有限公司；超纯水系统，Milli-Q Advantage A10，默克密理博有限公司。

1.3富硒芪云水提物的制备 黄芪、紫云英粉碎，分别准确称取100 g混合后，加100℃纯净水2 000 mL浸泡60 min，回流提取60 min，120目网筛过滤，药渣重复提取2次，合并滤液浓缩至1 000 m L，获400 mg/mL富硒芪云水提物，临用时稀释至100、200、400 mg/mL，相当于生药1.95、3.9、7.8 g/kg。黄芪水提物、紫云英水提物同法制备。

1.4方法

1.4.1S180荷瘤鼠模型的建立［8-9］及分组给药 S180肿瘤细胞株接种于昆明小鼠腹腔，抽取腹水，细胞计数调整密度为1×107个/m L，按0.2 mL/只接种于小鼠右前腋皮下，复制S180荷瘤小鼠模型。造模24 h后，随机分为模型组、黄芪提取物组（3.9 g/kg）、紫云英提取物组（3.9 g/kg）、富硒芪云水提物低、中、高剂量组（1.95、3.9、7.8 g/kg）、环磷酰胺组（60 mg/kg），每组12只。药物组每日灌胃给药，给药体积为0.2 mL/10 g；模型组给予等容量的生理盐水，每日1次，连续10 d；阳性药物组腹腔注射环磷酰胺，间日1次，连续给药3次。

1.4.2指标检测 末次药后，用3.5%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血并分离血清，检测小鼠血清SBP1、GPX 1、AMPK、ROS水平，严格按照试剂盒操作；剥离肿瘤组织，称定质量计算抑瘤率，抑瘤率≥30%以上认为受试物具有一定的抗肿瘤作用。

1.5统计学分析 实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，以均数标准差（±s）表示，各组间采用单因素方差分析，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

2　结果

2.1富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用 与模型组比较，阳性药物组能显著抑制S180移植性实体瘤生长（P＜0.01），抑瘤率高达56.20%，同时能抑制小鼠体质量增长（P＜0.01）；黄芪组、紫云英组以及富硒芪云水提物低剂量组肿瘤抑制作用不明显；富硒芪云水提物中、高剂量组均能显著抑制S180实体瘤生长（P＜0.01），抑瘤率分别为44.92%、38.70%，同时无明显抑制小鼠体质量增加的作用。见表1。

表1　富硒芪云水提物对S180移植性实体瘤的抑制作用（±s，n=12）

表1　富硒芪云水提物对S180移植性实体瘤的抑制作用（±s，n=12）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别剂量/（g·kg-1）末体质量/初体质量瘤质量/ g抑瘤率/ %模型组-1.04±0.07 2.28±0.55-环磷酰胺组0.06 0.90±0.08**1.00±0.47**56.20黄芪组3.90 1.00±0.04 1.72±0.37 24.63紫云英组3.90 1.10±0.13 1.87±0.70 18.02富硒芪云组1.95 1.06±0.03 1.97±0.91 13.64富硒芪云组3.90 1.02±0.03 1.25±0.50**44.92富硒芪云组7.80 1.06±0.08 1.40±0.61**38.70

2.2富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠血清SBP1及GXP1的影响 与正常对照组比较，模型组小鼠血清SBP1水平、GXP1活性显著降低；与模型对照组比较，环磷酰胺组、紫云英组SBP1、GXP1升高不显著，黄芪及富硒芪云水提物各剂量组血清SBP1、GXP1明显上升（P＜0.01）；与黄芪组比较，富硒芪云水提物3.9 g/kg组SBP1水平升高明显（P＜0.01），富硒芪云水提物3.9 g/kg、7.8 g/kg组GXP1活性明显升高（P＜0.01）；与紫云英组比较，富硒芪云水提物3.9 g/kg、7.8 g/kg组SBP1、GXP1水平升高明显（P＜0.01）。见表2。

表2　富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠血清SBP1、GXP-1、AMPK及ROS的影响（±s，n=12）

表2　富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠血清SBP1、GXP-1、AMPK及ROS的影响（±s，n=12）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与黄芪组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与紫云英组比较，△△P＜0.01

组别剂量/（g·kg-1）SBP1/（ng·L-1）GPX1/（ng·L-1）AMPK/（U·L-1）ROS/（U·mL-1）正常组-98.98±7.50**25.05±2.803**13.84±1.67**269.10±45.14**模型组-81.44±4.28 20.73±2.06 11.44±0.84 349.66±28.35环磷酰胺组0.06 84.49±6.47 20.77±1.98 12.27±1.11 330.82±45.75黄芪组3.90 97.41±6.90**22.89±1.66*13.29±1.51**281.63±40.75**B紫云英组3.90 87.74±5.82 22.31±2.95 12.13±1.30 323.05±32.89富硒芪云组1.95 91.03±6.54**21.323±2.04 12.43±1.22 266.87±26.84**A富硒芪云组3.90 108.82±8.62**##26.25±2.15**##△△15.42±1.66**##△△237.10±39.04**#△△富硒芪云组7.80 102.54±7.58**25.12±1.52**#△△14.69±1.31**#△△253.09±50.66**△△

2.3富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠血清AMPK活性的影响 与正常对照组比较，模型组小鼠血清AMPK活性明显低于正常对照组（P＜0.01）；与模型对照组比较，环磷酰胺组、紫云英组AMPK活性升高不显著，黄芪组、富硒芪云水提物3.9 g/kg和7.8 g/kg组血清AMPK活性明显上升（P＜0.01）；与黄芪组比较，富硒芪云水提物3.9 g/kg和7.8 g/kg组AMPK活性升高（分别为P＜0.01、P＜0.05）。与紫云英组比较，富硒芪云水提物3.9 g/kg和7.8 g/kg组AMPK活性升高（P＜0.01）。见表2。

2.4富硒芪云水提物对S180荷瘤小鼠血清ROS水平的影响

模型组小鼠血清ROS水平显著高于正常对照组（P＜0.01）；与模型对照组比较，环磷酰胺组、紫云英组ROS水平降低不明显，黄芪水提物及富硒芪云水提物各剂量组血清ROS水平明显降低（P＜0.01）；与黄芪组比较，富硒芪云水提物3.9 g/kg组ROS水平降低（P＜0.05）；与紫云英组比较，富硒芪云水提物各剂量组ROS水平降低（P＜0.01），黄芪组ROS降低（P＜0.05）。见表2。

3　讨论

研究发现，中药单独应用具有显著的抗肿瘤作用［10］，且与化疗药物联合应用具有增强药效、克服耐药、缓解癌症疼痛、抑制癌症转移以及减轻不良反应等优点［11-12］。黄芪为补益类抗肿瘤中药，紫云英同为黄芪属中药且具解毒止痛功效，本研究在前期成功复制小鼠荷瘤模型研究基础上，以中医抗肿瘤“扶正祛邪”理论为指导，采用黄芪与紫云英1∶1配伍进行干预，结果显示富硒芪云水提物3.9 g/kg和7.8 g/kg剂量组瘤质量明显低于模型组（P＜0.05），抑瘤率＞30%。与环磷酰胺组比较，富硒芪云水提物3.9 g/kg剂量组抑瘤率无显著性差异。结果表明富硒芪云水提物3.9 g/kg和7.8 g/kg剂量组具有抑制肿瘤作用。

肿瘤微环境主要是由肿瘤细胞、基质组织以及细胞外基质组成的多维空间结构，氧化还原水平异常，能量代谢失衡，活性氧簇水平升高能影响其自身内环境，是微环境特异性特征［13］。微量元素硒在体内主要以硒蛋白形式参与调节蛋白质的氧化还原状态，平衡细胞内氧化还原水平发挥抗肿瘤作用［14］。硒结合蛋白1（SBP1）参与细胞内高尔基体蛋白的合成及物质转运，广泛表达于多种组织及细胞，在缺氧条件下，经低氧诱导因子lα介导，通过改变VDH1酶的活性或者直接与希佩尔-林道蛋白（VHL蛋白）之间交换［15］，防止泛素化蛋白酶体降解过程中VHL蛋白突变从而抑制肿瘤的发生。SBP1为目前硒抗肿瘤作用最有潜力的标志物之一，其表达减少与癌症患者生存率低有关［16］。谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）为氧化还原酶，见于线粒体以及胞浆中，为人体内含有量最高、表达最广泛的硒蛋白之一。GPX1能减少癌症细胞的氧化应激反应，Kang等［17］研究发现，GPX1能有效地保护DNA和蛋白质的过氧化氢诱导的氧化损伤，提高抗氧化防御系统。本实验结果显示，模型组荷瘤小鼠SBP1、GPX1显著降低，治疗后，富硒芪云组SBP1、GPX1水平明显上升，其中3.9 g/kg、7.8 g/kg剂量组效果更显著。

能量代谢异常为肿瘤细胞区别于正常细胞的一大显著特征，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）被称为“细胞能量调节器”，广泛存在于真核细胞生物中，是一种高度保守的蛋白激酶，用于调节细胞能量代谢平衡［18］。当细胞内AMP/ATP比率增高时AMPK被激活，启动生成ATP的分解代谢途径，同时抑制消耗ATP的合成代谢途径。AMPK的激活能抑制肿瘤细胞生长、增殖过程中必需营养物质蛋白质、脂肪酸、多糖等的合成［19］。活性氧（ROS）为生物有氧代谢的产物，是过氧化氢、超氧阴离子、单线氧态及羟自由基等一类物质总称。细胞内ROS主要来源于线粒体，当活性氧自由基的产生和清除这一动态平衡被破坏时，会损害机体的氧化应激环境［20］。氧化应激下引起线粒体结构改变产生功能障碍，造成能量产生减少，ROS生成增多［21］。大量ROS可以造成线粒体功能障碍，引起蛋白质、DNA、RNA等生物大分子的氧化损伤反应，改变其结构功能，从而引起肿瘤的发生、恶化［22］。本实验结果显示，富硒芪云组能提高AMPK活性、降低ROS水平，且3.9 g/kg、7.8 g/kg剂量组效果更显著。

综上所述，富硒芪云水提物能抑制荷瘤小鼠肿瘤组织的增长，升高含硒蛋白GPX1、SBP1水平，减少线粒体氧化损伤，激活AMPK，提高线粒体有氧氧化作用，清除体内过多的ROS，可能是其影响肿瘤微环境发挥抗肿瘤作用的途径之一。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0623-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.035

2014-11-09

安徽省研究生“千人培养计划”项目资助（2012）

高华武（1987—），男，硕士生，从事中药对肿瘤防治作用的研究。Tel：15156071673，E-mail：ghw445673028@163.com

龙子江，男，教授。Tel：（0551）65169216，E-mail：lzjyls@163.com