指纹图谱技术在中药注射剂标准提高中的应用

聂黎行， 石上梅， 翟为民， 戴 忠， 马双成

（1.中国食品药品检定研究院，北京　100050；2.国家药典委员会，北京　100061）

［综 述］

指纹图谱技术在中药注射剂标准提高中的应用

聂黎行1， 石上梅2*， 翟为民2， 戴 忠1， 马双成1

（1.中国食品药品检定研究院，北京100050；2.国家药典委员会，北京100061）

本文从整体情况、测定条件和评价方式三个方面对新颁布的中药注射剂标准中指纹图谱检测项加以分析和整理。结果可知中药注射剂指纹图谱标准普遍采用高效液相检测，梯度洗脱，一般要求固定色谱柱型号和柱温，样品直接进样或经简单处理，大部分品种以相似度作为评价指标。指纹图谱技术在中药注射剂标准提高中的应用日趋成熟，对保障药品的有效、均一具有重要意义。

中药注射剂；指纹图谱；标准提高

中药注射剂是在口服方剂基础上发展起来的现代新剂型，它改变了传统的给药方式，有效成分经提取精制后直接进入人体，生物利用率高，便于临床使用，其剂量准确、吸收快、作用迅速、疗效确切的优点已获得认可。据统计，我国现有中药注射剂130余种，年销售额数百亿，在心脑血管疾病、肿瘤辅助治疗和抗细菌抗病毒感染方面的应用尤为成功。随着临床应用的日益广泛，中药注射剂的不良反应报道也相应增加，引起了社会的关注。国家食品药品监督管理总局（原国家食品药品监督管理局，以下简称“国家局”）对中药注射剂的安全和质量高度重视，早在1999年就出台了《中药注射剂研究的技术要求》。为适应制剂工艺和分析水平的发展，于2007年组织制定了新的《中药、天然药物注射剂基本技术要求》，科学规范和指导中药、天然药物注射剂的研究工作；同时组织包括中国食品药品检定研究院在内的多家药检所对中药注射剂标准进行全面提高。2009年，国家食品药品监督管理总局开展了中药注射剂再评价工作，颁布了多个指导原则和技术要求，从生产工艺、质量控制、非临床及临床研究、风险评估等方面对已上市的中药注射剂进行全面监控，保证用药安全有效。

质量可控是中药注射剂安全有效的基础和保障，科学合理的质量标准是药品质量保证体系的重要组成部分。作为高风险品种，中药注射剂的质量标准比传统中药口服制剂更加严格，不仅安全性检查项目大幅增加，有效和指标性成分的控制也更为全面细致。虽经提取和精制，但多数中药注射剂仍属复杂混合体系，化学成分的多样性和复杂性是其发挥疗效的物质基础，同时也是质量评价的重点与难点。指纹图谱可以整体、宏观地表征被测样品主要化学成分的特征，经过多年的发展和应用，目前是公认的最适合中药及天然药物物质群质量控制的手段之一。

2000年国家食品药品监督管理总局在《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》中规定中药注射剂必需制定指纹图谱。2002年国家药典委员会（以下简称“药典会”）又下达了《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南》。中药注射剂标准提高和再评价工作也强调了指纹图谱的重要性，要求原料、中间体、制剂均应分别研究建立指纹图谱，并进行相关性研究。注射剂中含有的大类成分，一般都应在指纹图谱中得到体现，必要时应建立多张指纹图谱，以适应检测不同大类成分的需要。指纹图谱的相似程度可采用相似度等指标进行评价（狭义的指纹图谱），也可根据产品特点以特征峰比例等指标及指纹特征进行描述，并规定非共有峰数及相对峰面积限度等（狭义的特征图谱）。本文以近3年新颁布的中药注射剂标准中【指纹图谱】或【特征图谱】项目为载体，结合多年中药注射剂检验和标准修订工作实践经验，就指纹图谱技术在中药注射剂标准提高中的应用提出拙见，以期抛砖引玉、共同提高。

1　中药注射剂标准中的指纹图谱项目

2010年版《中国药典》实施后至2013年，共新颁布实施了24个中药注射剂标准，1个注射用原料标准。除清开灵注射液收载于2010年版《中国药典》外，其余均以单页标准形式发布。原标准多为卫生部或国家局药品标准，大部分未规定指纹图谱检测项目，标准提高工作承担单位根据品种各自的特点，在修订标准中研究并制定了指纹图谱或特征图谱检测方法。按处方分类，注射用薏苡仁油［1］、康莱特注射液［2］、血栓通注射液［3］、注射用血栓通（冻干）［4］、血塞通注射液［5］、注射用血塞通（冻干）［6］、喜炎平注射液［7］7个品种原料为中药有效部位，占29%；舒血宁注射液［8］、柴胡注射液［9］、丹参注射液［10］、红花注射液［11］4个品种由单味药材或提取物制备，占17%；参附注射液［12］、参麦注射液［13］、生脉注射液［14］、注射用益气复脉（冻干）［15］、参芪扶正注射液［16］、双黄连注射液［17］、康艾注射液［18］、喘可治注射液［19］、冠心宁注射液［20］9个品种由2～3味原料药材制得，占37%；痰热清注射液［21］、脉络宁注射液［22］、血必净注射液［23］、清开灵注射液［24］4个品种处方在5味以上，占17%，其中清开灵注射液最为复杂，由八味药材制得。组方药味越多，指纹图谱研究难度越大，需要建立分离度高、信息量大的分析方法，尽可能地体现对每味药材的质量控制。痰热清注射液是24个提高标准中唯一规定两项指纹图谱检测的标准，以HPLCELSD法测定氨基酸，控制熊胆粉、山羊角投料；HPLC-UV法测定280 nm下色谱，控制黄芩、金银花和连翘投料，达到了全方质控的目的。

2　指纹图谱的建立

随着分析仪器的进步，指纹图谱的检测技术也在不断发展，由最初的薄层色谱（TLC）法发展到液相色谱（HPLC）法［25-26］和气相色谱（GC）法［27-28］，超高效液相色谱（UPLC）的出现使得液相指纹图谱的分离度进一步提高［29-30］，检测时间大大缩短，而液质联用（HPLCMS）［31-32］和气质联用（GC-MS）［33-34］技术的推广也扩展了指纹图谱的分析范围，丰富了化学信息。计算机辅助技术的发展使得红外（IR）［35-36］、近红外（NIR）［37］、核磁共振（NMR）［38］及X射线衍射［39］等波谱方法，等离子体质谱（ICP-MS）［40］等元素分析手段评价中药复杂混合体系的指纹特征成为可能。还有学者通过DNA技术，从生物学角度阐释中药的指纹信息［41］。出于对方法适用性和可操作性的考虑，目前中药注射剂质量标准一般仍选用普及程度最广、发展最为成熟的HPLC或GC法测定指纹图谱。24个提高标准25个指纹图谱项，除1项（柴胡注射液）采用GC法，其余均采用HPLC法检测。为保证专属性，起草单位在进行标准研究时也同时对指纹图谱中的主要特征峰进行了药材归属和质谱指认［42-43］。主要化学成分峰分离度好的指纹图谱，常常与含量测定采用相同色谱条件，供试品进样一次用于两项检测，24个标准中有11个指纹图谱可与含量测定同时进行。除注射液用薏苡仁油及其制剂康莱特注射液外，其余品种指纹图谱流动相均采用梯度洗脱，洗脱时间由55 min至120 min不等。与一般含量测定不同，指纹图谱检验往往通过色谱峰群的整体特征进行判断，且多采用梯度洗脱，因此对结果重现性要求较高。经验表明，色谱仪品牌、型号的差异对分离度、出峰顺序及峰群面貌的影响远远小于色谱柱的型号和柱温改变造成的影响。出于以上考虑，标准起草单位在指纹图谱研究初期即对不同色谱柱进行了考察。经比较25个指纹图谱仅有9个未指定色谱柱型号，其余均在“色谱条件与系统适应性试验”项下注明了色谱柱的厂家、型号和规格。丹参注射液标准虽未规定色谱柱，但在对照指纹图谱下方标注了生成对照指纹图谱使用的色谱仪和色谱柱型号。柱温方面，除GC指纹图谱对升温程序有明确规定外，大部分HPLC指纹图谱要求固定柱温，其中规定25℃的6个，30℃的8个，35℃的4个，40℃的3个，仅3个指纹图谱未对柱温做出要求。由于注射剂较之其他中药制剂，成分相对简单，25项指纹图谱检测所需的供试品溶液中，有22项只需直接进样或者溶解/稀释后进样，其余需要前处理的品种操作也较简单，痰热清注射液氨基酸指纹图谱需柱前衍生化，参芪扶正注射液经正丁醇提取后进样测定，康艾注射液供试品溶液由固相萃取小柱净化制备。值得一提的是，尽管标准起草单位在方法学考察阶段进行过较全面的耐用性试验，但仪器状态、色谱柱使用程度、流动相试剂厂家、色谱峰积分参数等因素都有可能引起不同实验室测定结果的偏差。检验人员在实际操作时应首先进行系统适用性试验，确保分析条件满足标准要求，基线平稳，主要特征峰分离良好。

3　指纹图谱的评价方式

好的检测条件可以帮助分析人员获得准确的、反映样品化学特征全貌的指纹图谱，在此基础上加以科学、合理的评价也是质量控制的重要环节。色谱峰数量、保留时间和面积的变化可以反映药品内在质量的差异，如何将这种差异科学客观地表达是中药注射剂标准建立过程需要解决的问题之一。指纹图谱的评价方式早已从最初的直观比较发展到数字化解读，一般基于相对保留时间和相对峰面积这两个核心参数，结合化学计量学方法对图谱加以综合的半定量评价。近年来很多学者将模式识别技术用于指纹图谱信息的挖掘和表达［44-45］，但模型转移和算法共享等问题限制了其在药品质量标准中的应用。

按结果判断方式分类，目前中药标准中获得广泛认可并且普遍使用的是特征图谱和指纹图谱两种检测方法。前者一般要求若干特征峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积在规定值的±n%以内，后者以夹角余弦法计算样品指纹图谱与对照指纹图谱的整体相似度并规定下限。从广义上讲，特征图谱仍旧是指纹图谱的一种，当n取值较小时，狭义的特征图谱比狭义的指纹图谱限度更为严格。对于成分复杂的药品，采用特征图谱模式评价质量，如果特征峰选取数量过少，难以体现整体特性；而特征峰数目的增加会加重手工选择、计算的工作量，且容易引入人为误差。2004年我国颁布了具有自主知识产权的《中国色谱指纹图谱相似度评价系统》（A、B版），用于中药指纹图谱相似度的计算，能定量比对图谱整体相似程度的工具。此后根据实际使用效果总结经验，不断改进和完善软件的功能，于2009年推出了新版《中国色谱指纹图谱相似度评价系统》（2.0版）。2012年，国家药典委员会组织制定和建立了中药色谱指纹图谱电子标准图谱及其相似度评价软件系统，通过互联网正式对外开放（http：//fp.chp.org.cn），用户可以在该系统下载相似度评价软件及对照指纹图谱。

本文总结的24个中药注射剂提高标准，除柴胡注射液标准要求6个特征峰的相对保留时间在规定时间的±8%范围内外，其余标准均采用指纹图谱模式，不仅要求检出特征峰，还以相似度为指标控制样品质量。其中，注射用益气复脉和舒血宁注射液标准分别采用益气复脉对照提取物和银杏叶对照提取物作为实物对照，检验时与样品随行测定，以供试品溶液指纹图谱与对照提取物溶液指纹图谱的相似度进行评价。剩余21个品种22个指纹图谱项，起草单位在标准修订阶段建立了相应对照指纹图谱，上报药典会，电子文件随标准同时颁布。检验时只需测定样品，计算供试品溶液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。具体地，尚有全谱相似度与特征峰相似度之分，检验人员在应用指纹图谱评价软件时应注意点选不同的相似度计算功能。以参附注射液和参麦注射液为例，前者标准规定“在9～105 min范围内，本品指纹图谱与参附注射液对照指纹图谱比较，相似度应不得低于0.9”，这时需点击“全谱峰匹配”计算相似度（见图1）；后者标准规定“在8～90 min范围内，应呈现16个与参麦注射液对照指纹图谱相对应的特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，以特征峰计算相似度，本品指纹图谱与参麦注射液对照指纹图谱比较，相似度不得低于0.85”，这时需要根据保留时间的先后顺序及峰貌特征，以对照品指纹图谱为尺，在供试品指纹图谱中选中16个相对应的特征峰后，点击“Mark峰匹配”，计算相似度（见图2）。部分品种，如参麦注射液、生脉注射液，除对特征峰相似度有下限要求外，尚规定非特征峰占总峰面积的比例不得高于上限，软件在计算相似度时，会同时给出非特征峰比例。由于面积较大的色谱峰对相似度的贡献较多，可能掩蔽其他成分的差异，为更加全面、细致地评价中药注射剂整体质量，可以在计算相似度时将含量特别高或者响应特别强的组分对应色谱峰剪除。如双黄连注射液指纹图谱中，黄芩苷峰面积显著高于其他成分，标准规定“删除10号峰，将供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，黄芩苷作为含量测定项的指标。根据实际情况，不同品种相似度的计算方式及限度有所差异（见表1），一般情况下，有效部位制成的注射剂或独家产品由于原料和生产工艺相对固定，药品质量均一性和稳定性更有保障，相似度要求较高。

图1　全谱峰匹配模式计算相似度

图2　特征峰匹配模式计算相似度

表1　23个中药注射剂标准指纹图谱相似度计算模式及限度

4　展望

指纹图谱技术自上世纪末引入我国以来，在中药质量控制领域始终发挥着积极作用，尤其是在中药注射剂质量标准提高中，已得到全面、成熟的应用。药典委分别于2012年和2013年组织了两期全国范围的“中药色谱指纹图谱电子标准图谱及其相似度评价系统专项培训”，本文作者们作为培训班的授课讲师，深切地感受到了来自药检系统和药品生产企业的工作人员对掌握和运用指纹图谱技术，把好药品质量关的渴望，同时也感到正确的引导和规范在中药指纹图谱检验工作中的重要性。对于中药注射剂，必须始终坚持高标准、严要求，鼓励采用综合手段对质量进行多维、全方控制，积极尝试新技术、新方法，探索更加准确、客观、全面的评价方式。将指纹图谱技术独特的优势用于药品的研究、生产和质量控制等环节，有助于提高工艺水平、完善质量标准、保证用药安全、有效。

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［9］ WS3-B-3297-98-2011，柴胡注射液标准［S］.2011.

［10］ WS3-B-3766-98-2011，丹参注射液标准［S］.2011.

［11］ WS3-B-3825-98-2012，红花注射液标准［S］.2012.

［12］ WS3-B-3427-98-2013，参附注射液标准［S］.2013.

［13］ WS3-B-3428-98-2010Z，参麦注射液标准［S］.2010.

［14］ WS3-B-2865-98-2011，生脉注射液标准［S］.2011.

［15］ YBZ07062006-2009Z-2011，注射用益气复脉（冻干）标准［S］.2011.

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［18］ WS-11222（ZD-1222）-2002-2012Z，康艾注射液标准［S］.2012.

［19］ WS3-839-（Z-164）-2004（Z）-2012，喘可治注射液标准［S］.2012.

［20］ WS3-B-3267-98-2012，冠心宁注射液标准［S］.2012.

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R284.1

A

1001-1528（2015）03-0607-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.032

2014-04-23

国家自然科学基金（81303194）

聂黎行，女，副研究员，主要从事中药质量控制和中药标准物质的研究。E-mail：nielixing@163.com

石上梅，女，主任药师，主要从事中药标准的研究与建立。E-mail：sm@chp.org.cn