海螵蛸质量标准研究

于 静， 顾青青， 缪潇瑶， 安 叡， 尤丽莎， 王新宏

（上海中医药大学，上海　201203）

海螵蛸质量标准研究

于 静， 顾青青， 缪潇瑶， 安 叡， 尤丽莎， 王新宏*

（上海中医药大学，上海201203）

目的 建立海螵蛸质量标准。方法 对浙江、山东、江苏、福建、广东、广西、云南、海南和辽宁省产的30批海螵蛸进行了显微鉴别并对其碳酸钙含有量、5种重金属［铜（Cu）、砷（As）、镉（Cd）、铅（Pb）和汞（Hg）］和水分、总灰分及酸不溶性灰分进行了测定。结果 碳酸钙在0.050 1～0.160 1 g范围内线性关系良好（r= 0.999 5）；平均加样回收率为100.9%，RSD 0.24%（n=9）；精密度试验RSD 0.10%（n=5）；重复性试验RSD 0.13%（n=5）；稳定性试验RSD 0.26%（n=5）。不同产地海螵蛸的碳酸钙含有量范围为83.20%～95.42%，平均值为90.09%；水分测定结果为0.92%～2.71%，平均值为1.79%；总灰分结果为83.50%～95.87%，平均值为90.66%；酸不溶性灰分结果为0.01%～0.34%，平均值为0.17%。2个样本含铜量超过限度、9个样本的含镉量超过限度。结论 规定碳酸钙含有量不得少于86.0%，可使93%的样本被覆盖在合格范围内；海螵蛸水分不得高于2.5%，可使96%的样本被覆盖在合格范围内。

海螵蛸；质量标准；碳酸钙；水分

海螵蛸为乌贼科动物无针乌贼Sepiella maindroni de Rochebrune或金乌贼Sepia esculenta Hoyle的干燥骨状内壳，具有收敛止血、涩精止带、制酸止痛、收湿敛疮等作用［1］。早在公元前三世纪左右，《黄帝内经》中已有乌贼骨作丸饮以鲍鱼汁治血枯的记载［2］。海螵蛸主要成分为碳酸钙，尚含多糖［3］、氨基酸［4］、壳角质、黏液质和多种微量元素。现代药理研究表明，海螵蛸所含的碳酸钙能中和胃酸，改变胃内容物pH，降低胃蛋白酶活性，促进溃疡面愈合，缓解呕酸及烧心症状，又可促进溃疡面炎症吸收，阻止出血，减轻局部疼痛。林乾良等［5］证明海螵蛸收敛作用源于富含的钙，方尔笠等［6］发现海螵蛸具有防治胃溃疡作用。此外，海螵蛸对妇科病［7］、眼病［8］、哮喘［9］和骨科病［10-12］等也有较好疗效。在《中国药典》2010年版一部海螵蛸项下，显微鉴别简单，无水分、灰分、酸不溶性灰分和重金属测定等内容［1］，难以达到有效控制药材质量的目的。为此，本实验收集不同产地海螵蛸样品，开展了相关研究，旨在为提升海螵蛸药材质量标准提供依据。

1　材料

1.1仪器7500Ce电感耦合等离子质谱仪（美国Agilent公司）；Mars-xp微波消解仪（美国CEM公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；Zentrifugen D78532 Tuffingen离心机（德国Hettich公司）；SZJX箱式电炉（上海阳光实验仪器有限公司）；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科技有限公司）；电子天平（BSA224S，赛多利斯科学仪器有限公司）；铁架台；滴定管（50 mL）；锥形瓶（250 mL）等。

1.2试剂 乙二胺四乙酸二钠（批号F20100223）、浓盐酸（批号T20100426）、氢氧化钾（批号T20090224）、氨水（批号20130606）、钙黄绿素指示剂（批号20130424）、甲基红（批号F20071107）均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；铬黑T（国药集团化学试剂有限公司，批号F20110330）；氧化锌（工作基准物质，天津市化学试剂研究所）；碳酸钙（上海泗联化工厂有限公司，批号130301）；硝酸为优级纯（美国Merck公司），水为去离子水。铜、砷、镉、汞和铅单元素标准溶液均购自国家标准物质中心，质量浓度均为1.000 g/L。

1.3样品 海螵蛸药材共30批次，分别购自浙江、上海、安徽、河北、江苏、北京、辽宁等地，经上海中医药大学吴立宏研究员鉴定，均符合《中国药典》2010年版一部海螵蛸项下规定。样品收集信息见表1。

表1　海螵蛸样品收集信息Tab.1 Information on cuttlebone samp les collected

2　方法与结果

2.1粉末显微鉴别 《中国药典》2010年版一部的海螵蛸鉴别项为：本品粉末类白色。多数为不规则透明薄片，有的具细条纹。不规则碎块，表面显网状或点状纹理［1］。

而经过本课题组进一步对海螵蛸粉末的显微鉴别，其显微特征见图1，可表述为：本品粉末类白色。背面角质层碎块多类四边形，表面具横裂纹和细密纵纹交织而成的网状纹理，亦可见只有纵纹的碎块。中间及腹侧石灰质碎块多具分支状蛇形管道；棱柱体碎块基部膨大，柄呈柱状，有的类T形；一般石灰质碎块呈条形、类四边形或不规则状，具细条纹。

图1　海螵蛸粉末特征Fig.1 Powder characteristics of cuttlebone

2.2碳酸钙测定

2.2.1EDTA配制与标定 参照《中国药典》2010年版二部附录XV F乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05 mol/L）的配制与标定方法［13］进行配制与标定。

2.2.2EDTA配位滴定法 取本品细粉约0.12 g，精密称定，置于锥形瓶中，加稀盐酸10 mL，沸水浴加热使溶解，冷却，加水20 mL与甲基红指示剂1滴，滴加10%KOH溶液至溶液显微黄色，继续多加10 mL，并加钙黄绿素指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05 mol/L）滴定至黄绿色荧光消失而显橙色。每1 mL乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05 mol/L）相当于5.004 mg碳酸钙（Ca-CO3）。

2.2.3线性关系考察 分别称取碳酸钙对照品0.050 1、0.075 0、0.100 0、0.120 0、0.140 1、0.160 1 g，精密称定，按照“2.2.2 EDTA配位滴定法”，测定各对照品消耗EDTA-2Na滴定液的体积。以碳酸钙对照品量为横坐标（X），消耗的滴定液体积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。线性方程为Y=197.4X（r=0.999 5），表明碳酸钙在0.050 1～0.160 1 g范围内线性关系良好。

2.2.4精密度试验 称取碳酸钙对照品5份，各约0.10 g，精密称定，依照“2.2.2 EDTA配位滴定法”连续测定碳酸钙量。结果平均含有量为99.70%，RSD为0.10%，表明该方法精密度良好，符合分析方法的要求。

2.2.5重复性试验 称取第3批海螵蛸样品细粉5份，各约0.12 g，精密称定，依照“2.2.2”项连续测定碳酸钙。结果样品中碳酸钙平均含有量为92.21%，RSD为0.13%，表明该方法重复性良好，符合相关要求。

2.2.6稳定性试验 称取第3批海螵蛸样品细粉5份，各约0.12 g，精密称定，置于锥形瓶中，加稀盐酸10 mL，加热使溶解，放置0、2、4、6、8 h后依照“2.2.2”项测定碳酸钙。稳定性试验RSD为0.26%，表明样品溶解后所含成分在8 h内稳定。

2.2.7加样回收试验 分别称取一定量的碳酸钙对照品9份，精密称定，加入到已知碳酸钙含有量的第3批次样品粉末中，加入量分别达到已知碳酸钙量的80%、100%、120%，按照“2.2.2 EDTA配位滴定法”测定碳酸钙，结果见表2。平均回收率为100.9%，RSD为0.24%，表明采用该方法测定样品中碳酸钙回收率高，准确性好。

表2　加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests

2.3样品测定 分别称取各批次海螵蛸细粉约0.12 g，按照“2.2.2”项测定，每批平行测定3份，计算碳酸钙量（以干燥品计），结果见表3。

2.4检查

2.4.1水分的测定 称取各批次海螵蛸细粉约2 g（过五号筛），精密称定，按照《中国药典》（2010年版一部）附录ⅨH水分测定法第一法［1］进行测定。每批平行测定3份，结果见表3。

2.4.2总灰分、酸不溶性灰分的测定 称取各批次海螵蛸细粉约2 g（过五号筛），精密称定，按《中国药典》（2010年版一部）附录ⅨK总灰分、酸不溶性灰分测定法［1］测定。每批平行测定3份，结果见表3。

表3　碳酸钙、水分、总灰分和酸不溶性灰分的测定（n= 3）Tab.3 Results of the content of CaCO3，water，ash and acid-insoluble ash（n=3）

2.4.3ICP-MS法测定海螵蛸中5种重金属

2.4.3.1ICP-MS测定工作条件 射频功率1 250 W，采样深度7 mm，等离子气体积流量15.8 L/min，辅助气体积流量1.0 L/min，载气体积流量0.9 L/min，采样锥孔径1.0 mm，截取锥孔径0.7 mm，雾化室温度2℃，数据采集重复3次。

2.4.3.2供试品溶液的制备 精密称取本品细粉0.5 g，置耐压耐高温微波消解罐中，加优级纯硝酸5 mL，按各微波消解仪的要求密闭样品消解罐，按表4消解程序消解，消解完全后，冷却消解液低于60℃，取出消解罐，放冷，将消解液转移至50 mL聚四氟乙烯材料的量瓶中，用去离子水少量洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入1μg/mL的标准金溶液50μL，用去离子水稀释至刻度，摇匀，即得。同时另加优级纯硝酸5 mL，置耐压耐高温微波消解罐中，同供试品溶液制备方法制备样品空白溶液。

表4　微波消解程序Tab.4 M icrowave digestion procedure

2.4.3.3样品分析 照《中国药典》2010年版一部附录ⅨB铅、砷、汞、镉、铜测定法［1］对抽取的11批次不同来源的海螵蛸样品中铅、砷、镉、汞、铜元素进行测定，测定结果见表5。

表5　5种重金属检测结果（mg·kg-1，n=3）Tab.5 Results of the content of five kinds of heavy metal（mg·kg-1，n=3）

注：镉（以Cd计）最低检出限为0.003 mg·kg-1汞（以Hg计）最低检出限为0.004 mg·kg-1

3　讨论

3.1本实验对海螵蛸中碳酸钙量进行了测定，所采用的方法操作简便，结果准确可靠，可有效地控制海螵蛸质量。另外，贝壳类药材所含钙的存在形式主要为碳酸钙，也可能含少量磷酸钙。为研究海螵蛸中磷酸钙是否对碳酸钙的测定产生影响，采用了磷钼蓝法［14］测定海螵蛸中磷酸根的量，结果显示磷酸根仅为0.003 4%（g/g）。说明海螵蛸中磷酸钙含有量甚微，海螵蛸中钙离子主要以碳酸钙形式存在，通过本研究建立的方法得到碳酸钙的含有量结果是准确合理的。

本实验收集了不同产地的海螵蛸共30批，样品具有一定的代表性，根据测定结果，不同产地海螵蛸的碳酸钙含有量范围为83.20%～95.46%，平均值为90.09%。不同产地海螵蛸的水分含有量范围为0.92%～2.71%，平均值为1.79%。根据不同产地海螵蛸的碳酸钙和水分测定结果，暂规定碳酸钙含有量不得少于86.0%，可使93%的样本被覆盖在合格范围内；海螵蛸水分不得高于2.5%，可使96%的样本被覆盖在合格范围内。

3.2由海螵蛸总灰分所测值均大于80%，可知其属于生理性灰分高的药材，经分析，所有批次海螵蛸所含总灰分和碳酸钙含量均相近。因此，碳酸钙为海螵蛸总灰分的主要组成，这与李兰等［2］应用X-ray的衍射分析和热分析技术证明海螵蛸主要成分为碳酸钙和刘永刚等［15］认为海螵蛸主要的功效归于其丰富的碳酸钙含量相符合。碳酸钙对于一些植物性药材而言属于总灰分，但是海螵蛸主要成分为碳酸钙，属于其自有成分，可以直接测定碳酸钙的量代替测定总灰分；而其酸不溶性灰分值均未超过0.34%，说明非金属氧化物如SiO2等、酸不溶性金属氧化物如AlO3等以及酸不溶性硫酸盐、卤化物等酸不溶性灰分含有量甚少，不足以影响海螵蛸质量和药效，无须作为质量控制指标。

3.3中药中有害重金属元素通常指铜（Cu）、砷（As）、镉（Cd）、铅（Pb）和汞（Hg）等。《中国药典》2010年版一部对黄芪、甘草、白芍、丹参、金银花、西洋参、山楂、枸杞子等重金属含有量规定了限度：铜（Cu）≤20.0 mg/kg，砷（As）≤2.0 mg/kg，镉（Cd）≤0.3 mg/kg，铅（Pb）≤5.0 mg/kg，汞（Hg）≤0.2 mg/kg。所抽取的11批次海螵蛸样品，分别来自不同产地或收集地，取样具有一定的广泛性和代表性，结果5种重金属元素含有量差别较大，但大部分样品均检测到铜、镉、铅、砷，表明这4种元素在海螵蛸样品中普遍存在。其中铜元素含有量范围为0.950～23.68 mg/kg，砷元素含有量范围2.691～8.374 mg/kg，镉元素含有量范围为0.150～6.722mg/kg，铅元素含有量范围为0～0.200 mg/kg，汞元素均未检出。经比较分析，对于铜元素，有2个样品超过限度，其余样品均符合国家药典标准；而有9个样本的镉元素超过限度；铅元素含有量均远低于限度；而砷元素含有量均超过限度，须引起足够重视。

3.4中药质量标准的制定，应根据药材或饮片的具体特征规定检测项目、真实反映其质量的指标和限度，以确保其安全有效。结合本实验结果和海螵蛸药理文献资料，经综合分析，将碳酸钙含有量作为海螵蛸中成分定量测定项，可建立符合中医药特点的质量标准体系。

致谢：真诚感谢中国药科大学李会军教授在海螵蛸粉末显微鉴定过程中给予的帮助与支持！

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［2］ 李 兰，吴启南.海螵蛸的化学成分研究［J］.现代中药研究与实践，2009（2）：52-54.

［3］ 魏江洲，张建鹏，刘军华，等.海螵蛸多糖CPS-1对小鼠实验性渍疡性结肠炎作用的初步观察［J］.第二军医大学学报，2006，27（1）：28-30.

［4］ 赵中杰，江佩芬，李 昂.海螵蛸中碳酸钙、微量元素和氨基酸的测定［J］.中国中药杂志，1990，15（1）：41-43.

［5］ 林乾良.海洋动物药的临床应用［J］.海洋药物，1984（2）：3.

［6］ 方尔笠，顾 洛，田苏平，等.海螵蛸防治胃溃疡作用的机理探讨［J］.中国中西医结合杂志，1994（2）：101-103.

［7］ 周俊兵.海洋药物妇科应用的文献整理［J］.南京中医药大学学报：社会科学版，2002，3（2）：87-88.

［8］ 郑晓明.海螵蛸治疗眼病一得［J］.实用中医药杂志，2006，22（2）：107.

［9］ 高淑琴.海螵蛸治疗慢性哮喘26例［J］.中国民间疗法，2007，15（5）：25.

［10］ 高 云，董福慧，郑 军.海螵蛸对骨愈合相关基因表达的影响［J］.中医正骨，2004，26（7）：1-3.

［11］ 刘 艺，顾国奎，刘克泉，等.海螵蛸接骨动物实验的组织学研究［J］.中国中医骨伤科研究，1995，3（5）：6-8.

［12］ 李建秋，李雪锋，周薇薇，等.海螵蛸颗粒剂干预尿毒症血透患者钙磷代谢的临床研究［J］.中国中西医结合肾病杂志，2012，13（3）：46-47.

［13］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版二部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［14］ 李素芹，张 军，王俊凤，等.磷钼蓝光度法测定磷酸钙中的磷含量［J］.无机盐工业，2008，40（3）：55-56，60.

［15］ 刘永刚，赵富花，何进来.海螵蛸的研究概况［J］.时珍国医国药，2005：16（1）：72-73.

Quality standard for cuttlebone

YU Jing， GU Qing-qing， MIAO Xiao-yao， AN Rui， YOU Li-sha， WANG Xin-hong*
（Shanghai Uniυersity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

AIM To establish the quality standard for cuttlebone（Sepiae endoconcha）.METHODS The identification of themicroscopic characteristics and the determinations of CaCO3，water content，ash content，acidinsoluble ash and five kinds of heavymetals of cuttlebone from Zhejiang，Shandong，Jiangsu，Fujian，Guangdong，Guangxi，Yunnan，Hainan and Liaoning Province were carried out.RESULTS The methodology validation for the assay of CaCO3presented the good linearity in the range of0.050 1-0.160 1 g，and the average recovery was100.9%with the RSD 0.24%（n=9）.In addition，the RSDs of reproducibility，precision and stability experimentswere 0.13%，0.10%and 0.26%，respectively.As a result，the contentof CaCO3，water，ash and acid-insoluble ash of cuttlebone from different batches ranged from 83.20%to 95.42%，0.92%to 2.71%，83.50%to 95.87%and 0.01%to 0.34%，respectively，and their averageswere 90.09%，1.79%，90.66%and 0.17%，correspondingly.Besides，Cu content of two sampleswas out of limitation，the same to Cd contentof nine samples. CONCLUSION If the standard of CaCO3content is higher than 86.0%，it covers 28 out of30 samples.Otherwise water content is lower than 2.5%，it covers 29 out of 30 samples of cuttlebone.

cuttlebone（Sepiae endoconcha）；quality standard；CaCO3；water content

R284.1

A

1001-1528（2015）03-0583-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.027

2014-04-14

国家“863”计划-海洋生物来源中药材质量标准研究（2013AA093002）

于 静（1990—），女，硕士生，主要从事中药质量标准研究。Tel：（021）51322450，E-mail：jingyu_peaceful@163.com

王新宏（1963—），男，教授，博士生导师，研究方向：药物分析。Tel：（021）51322183，E-mail：wangxinh6020@ 126.com