提高卷曲霉素的发酵质量

方媛 杨森 张昭

摘 要：硫酸卷曲霉素生产使用缠绕链霉菌，是多肽类结构的二线抗结核新型药物；在此次研究过程中，菌种分别采用紫外线诱变法和快中子辐射进行了菌种选预，经过菌种选育，使得发酵单位增长了10%以上；并且为了提高原液的质量，增加产品的品质，我们通过对过滤工艺的更新，将发酵液酸化pH值和过滤温度控制工艺优化试验，成功的减少了CAⅠ前杂质的产生。

关键词：卷曲霉素；菌种选育；过滤优化

卷曲霉素主要用于治疗结核病，结核病高发带在落后地区和贫困人群，提高技术指标、降低生产成本，不仅能给公司带来经济效益，也能带来良好的社会效益。发酵单位高低是影响卷曲霉素生产成本的主要因素之一，而菌种的不稳定性是造成发酵水平较低的主要原因。优良菌株的选育能大幅提高菌株产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进产品质量；是生产水平不断提高，使抗生素工业迅速发展的关键之一。由此我们将加大育种的力度并进行工艺优化，提高生产指标，降低成本。并且卷曲霉素原液中相关单杂的增加会直接影响卷曲霉素成品中有效组分的含量，降低产品的等级，影响销售价格，减少产品利润。为了不断提高产品质量，树立良好的企业形象，增加企业利润，满足客户对产品质量标准日益提高的要求，我们把提高原液质量作为发酵工段产品质量提高研究的重点。针对相关杂质主要为蛋白类物质的物化性质和产生原因，我们通过发酵液酸化pH值和过滤温度控制工艺优化试验，总结出两者与产品中杂质含量的关系。

1材料与方法

1.1菌种

缠绕链霉菌由华北制药华胜公司提供。

1.2 工艺简介

硫酸卷曲霉素发酵过程是以葡萄糖、淀粉、鱼粉、磷酸盐为主要碳、氮、磷源的液体培养基中，在27.5～32.5℃进行通气搅拌培养，经三级发酵生物合成卷曲霉素。发酵过程结束后，发酵液用草酸酸化、加热，过滤除去大量不溶性菌丝体、碱性蛋白、钙镁离子、培养基残渣等杂质。再用液体氢氧化钠中和。成为符合离子交换工艺要求的硫酸卷曲霉素原液。

1.3 高产菌株的诱变和选育

诱变育种是提高发酵水平的重要手段之一。其中，紫外线诱变法是微生物育种中最常用和比较有效的诱变法。快中子诱变法，具有较大的电离密度，能更多地引起点突变和染色体畸变，已有较多在抗生素产生菌的诱变育种中获得了明显效果的报道。我们利用经紫外线诱变后的高产突变株为出发菌株，快中子辐射后进行二次筛选。其诱变致死率和营养缺陷的诱发率均比单一诱变的要高。从中筛选出高产菌株JQ1001、JQ100B和JQ10-05，其摇瓶效价较出发菌株提高了15%左右，新菌株投入发酵生产使用后，较2014年年平均增长8.2%，并且具有良好的遗传稳定性。

表1 高产突变株稳定性实验

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][传代数

F1

F2

F3

F4

F5][JQ10-02

100.0

100.5

98.9

99.2

97.5][JQ1001

112.1

110.0

111.3

109.8

107.9][JQ100B

109.7

112.4

109.9

108.5

108.3][JQ10-05

110.3

110.8

110.7

108.6

108.6]

注：摇瓶效价相对出发菌株F1代按100.0计算。

如表格所示，该菌种具有良好的遗传稳定性；菌种工艺在经过优化之后，筛选出来高单位菌株，其菌株摇瓶效价平均达到10000 u/ml以上。相应卷曲霉素的发酵单位有了显著提高，新菌种应用的发酵罐批次，平均发酵单位要比原菌种提高8.2%。成功的降低了卷曲霉素的生产成本。

1.4 革新过滤工艺，提高原液质量

卷曲霉素过滤的工艺为：发酵结束后发酵液用草酸将pH调制酸性，然后加入助滤剂，用蒸汽加热至90℃。经板框过滤机过滤，酸性滤液冷却后用液体氢氧化钠溶液调pH至碱性。取样检验合格后交提取工序。但是由于原先工艺比较粗狂，导致原液的杂质含量一直较高，为此，针对相关杂质主要為蛋白类物质的物化性质和产生原因，我们通过发酵液酸化pH值和过滤温度控制工艺优化试验，总结出两者与产品中杂质含量的关系。如下表：

表2 加热时间对过滤前原液的CAⅠ前杂质的影响

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][加热时间/h

CAⅠ前杂质/%][2

0.01][3

0.05][4

0.10][5

0.23][6

0.39][7

0.50][8

0.78]

表3 pH值对过滤时间以及原液的CAⅠ前杂质的影响

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][pH值

过滤时间/h

CAⅠ前杂质/%][2.0

3

0.40][2.5

2

0.03][3.0

3

0.43][3.5

5

0.56][4.0

5

0.55][4.5

8

0.79][5.0

10

1.32]

由此可见，加热时间越短，过滤前原液的CAⅠ前杂质的产生就越低，过滤时间越短，其CAⅠ前杂质的产生就越低，针对这个情况，一方面我们把发酵液酸化pH值控制在2.5左右，提高了过滤速度；另一方面我们对过滤设备进行改造，在滤前罐与板框之间增加了一个管道加热器和维持罐，把加热的时间由原来的3～5小时减少到了2个小时，减少了CAⅠ前杂质的产生，新工艺实施后，虽然增加了工作量，但是原液中杂质含量明显降低，质量得到明显提高，CAⅠ前杂质含量均低于工艺要求的0.5%CAⅠ前杂质的产生百分含量，其中有30批次的罐原液CAI前杂质为0，占到总原液罐数的77.8%，成品分子质量合格率为100%，成品分子生物效价比2013年提高了10.2个百分点，在2014年巩固期，只有1罐原液CAI前杂质为0.3%，其余原液CAI前杂质均为0，原液质量得到进一步提升，成品分子质量也全部合格。

2 结论

①通过紫外线和快中子诱变法筛选后，从中筛选出高产菌株JQ1001、JQ100B和JQ10-05，其摇瓶效价较出发菌株提高了15%左右，新菌株投入发酵生产使用后，较2014年平均增长8.2%。并且具有良好的遗传稳定性。

②优化了现有的过滤工艺，确定了发酵液酸化pH值、对过滤设备进行了改造，优化了过滤温度控制工艺，降低了原液中杂质的含量，提高了原液质量。

参考文献：

[1]耿予欢，李国基，姚汝华，等.链霉素发酵的代谢调控育种及研究进展[J].现代食品科技，文章篇号：1007-2764（2006）04-0244-082.

作者简介：方媛，女，汉，河北保定人，供职于华北制药股份有限公司新制剂分厂，学士学位，研究方向：生物技术。