电化学柱后衍生-高效液相色谱法同时测定婴幼儿辅食中4种黄曲霉毒素

2015-10-16陈海玲蔡端容

分析科学学报 2015年5期

陈海玲，蔡端容

(1.泉州医学高等专科学校，福建泉州 362100 2.德国林内因斯特有限公司驻厦门代表处，福建厦门 361024)

黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是一类具有强毒性和致癌性的化合物[1,2]，目前分离鉴定出来的有20余种，主要污染粮油及其制品和动植物食品，如花生、大米、小麦、玉米、坚果类、乳制品等[3]。黄曲霉毒素的毒性大小依次为黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G2(AFG2)，因此，食品样品中AFB1、AFG1、AFB2、AFG2的同时检测是现在食品安全监测的热点之一[4 - 7]。婴幼儿时期是人生发展的重要阶段，也是最脆弱的时期，婴幼儿食品的安全不容马虎。市场上婴幼儿辅食种类、口味繁多，但材料常以米、面为主，如常见的婴幼儿米粉、营养面。国家标准(GB10765-2010)明确规定了婴儿配方食品中AFB1的限量为0.5 μg/kg[8]，该限量值明显低于谷物、豆类等其原料食品(5 μg/kg)[9]。欧盟国家要求更低，婴幼儿食品中AFB1的限量为0.1 μg/kg，总量(AFB1+ AFB2+GAF1+AFG2)不得超过4 μg/kg[10]。因此高灵敏同时测定婴幼儿食品中4种黄曲霉素非常重要。

黄曲霉毒素的常见检测方法主要有薄层色谱法[11]、酶联免疫分析法[12]、高效液相色谱法[13 - 17]、液相色谱串联质谱法[2,6,7,16,17]。本文利用电化学柱后衍生方法，针对低含量样品采用低标准线性系列，测定了多种婴幼儿辅食中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。方法重现性好，回收率高，检出限低，满足欧盟国家对婴幼儿辅食中黄曲霉毒素的限量要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20A液相色谱仪(日本，岛津公司)，配RF-10Axl荧光检测器；电化学衍生装置(德国，Coring cell,Code3200130)；磁力搅拌器(美国，Thermo)；研磨机(德国，IKA)；固相萃取装置(美国，Aglient)；电子天平(梅特勒-托利多(上海)公司；单道数字可调微量移液器(法国，吉尔森)；免疫亲和柱(1 mL，德国AFLAPREP)。

黄曲霉素标准品：AFB1：3.270 μg/mL，AFB2：2.890 μg/mL，AFG1：3.266 μg/mL，AFG2：3.131 μg/mL，国家标准物质网)。黄曲霉素标准溶液：分别准确吸取300 μL的AFB1、AFG1标准溶液，100 μL的AFB2、AFG2标准溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成AFB1、AFB2、AFG1、AFG2浓度分别为98.1、28.9、97.98、31.31 ng/mL的标准储备液。再用流动相制备AFB1为0.4905、0.9810、1.472、4.905、9.810 ng/mL，AFB2为0.1445、0.2890、0.4335、1.445、2.890 ng/mL，AFG1为0.4899、0.9798、1.470、4.899、9.798 ng/mL，AFG2为0.1566、0.3131、0.4698、1.566、3.131 ng/mL标准系列溶液。色谱流动相：准确称取0.1190 g KBr溶于600 mL水中，加200 mL甲醇、200 mL乙腈、100 μL浓HNO3，磁力搅拌15 min直至无分层现象，过0.45 μm有机滤膜。缓冲溶液：分别称取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、0.20 g KH2PO4、2.90 g NaH2PO4·12H2O于烧杯中，用水溶解后转移到1 L容量瓶中，用水定容至刻度，充分混合均匀，过0.45 μm滤膜。缓冲溶液于每次使用前配制。丙酮、甲醇、乙腈为色谱纯，HNO3为优级纯，其他所用试剂均为分析纯。实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 实验方法

1.2.1仪器工作条件色谱柱:Intersil ODS-SP C18柱(150×4.6 mm i.d.，5 μm)；荧光检测器：λex=362 nm，λem=440 nm；流动相流速：0.700 mL/min；进样量：50 μL，柱温：30 ℃。测试时液相流速从0.2000 mL/min逐步升到0.7000 mL/min，待压力稳定后，接通电化学衍生仪，工作电流为100 μA。

1.2.2样品提取及净化准确称取20.00 g米粉或营养面条样品(面条需粉碎)于250 mL锥形瓶中，加入80 mL丙酮∶水=4∶1(V/V)，磁力搅拌45 min，过滤。然后取2.00 mL滤液于带螺盖的离心管中，加入30 mL缓冲溶液，充分振荡均匀。将混合液转移至连接到固相萃取装置上的免疫亲和柱中，流速控制在1滴/秒。用20 mL缓冲溶液以5 mL/min的流速分三次淋洗柱子。用500 μL流动相分三次淋洗柱子，流速控制在1滴/秒。将收集到的洗脱液用0.22 μm有机滤膜过滤，供上机测试。

2 结果与讨论

2.1 衍生反应

电化学衍生装置Coring cell是利用电化学原理，以在线发生的Br2为衍生剂。测定时装置接通电源，流动相中的KBr在电流作用下被还原生成Br2，后者可与AFB1及AFG1反应产生其溴化物可提高荧光强度，反应如下：

图1 纯米粉样品(a)和加标200 μL标准储备液样品(b)的色谱图Fig.1 Chromatogram of rice flour sample(a) and sample spiked with 200 μL of aflatoxin stock standard(b)

2.2 色谱分析

在优化仪器工作条件下，对5个浓度梯度的标准溶液进行分析， AFG2、AFG1、AFB2、AFB1的出峰时间分别为17.8、22.3、23.7、30.0 min。按上述方法，空白纯米粉样品和加标200 μL的色谱图见图1。

2.3 工作曲线和检出限

按实验方法对黄曲霉素混合标准溶液进行测定，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2分别在0.4905～9.810、0.1445～2.890、0.4899～9.798、0.1566～3.131 ng/mL范围内与其响应信号成线性关系，线性回归方程分别为：y=4.238E-006x、y=2.422E-006x、y=4.581E-006x和y=3.881E-006x，相关系数分别为0.9995、0.9999、0.9998和0.9999。以3倍信噪比计算方法的检出限，得到纯米粉样品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的检出限分别为0.05、0.02、0.04、0.02 μg/kg。

2.4 精密度实验

选取4个不同品牌、不同种类的米粉、营养面条样品，按实验方法各平行处理6份进行测定，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的相对标准偏差(RSD)分别为2.0%～3.6%、2.7%～6.0%、1.7%～4.2%、1.1%～2.6%。取某品牌纯米粉样品，按实验方法平行处理6份进行测定，测得AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的日内RSD分别为2.1%、2.8%、2.5%、1.6%。连续处理3 d，每天平行处理6份，其日间RSD依次为6.7%、8.2%、6.0%、4.6%。