罗丹明6G荧光探针研究茄链格孢菌对啶酰菌胺的敏感性

2015-10-16李志英史晓晶杨琴琴

分析科学学报 2015年5期

李志英, 肖丽, 史晓晶, 杨琴琴

(忻州师范学院化学系，山西忻州 034000)

啶酰菌胺(Boscalid)是德国巴斯夫公司开发的新型酰胺类杀菌剂，主要用于防治植物的白粉病、早疫病、灰霉病、各种腐烂病和褐腐病等[1]。它几乎对所有类型的真菌病害都有活性，并且对其他的药剂的抗性菌亦有效。啶酰菌胺具有活性高、作用机理独特、杀菌谱较广、不易产生交互抗性及对作物安全等特点[2]。因此，研究植物病原菌对杀菌剂产生敏感性和抗药性的原因，以及抗性机制对有效防止或延缓对杀菌剂抗药性的产生具有重要的意义，这不仅可以加深对杀菌剂抗药性的认识，还可为正确提出和实施治理对策提供理论依据[3]。

传统的植物病原菌对农药的敏感性采用菌丝生长速率法进行测定，通过称量菌类重量，计算抑制率的方法来测定敏感性[4，5]。啶酰菌胺的检测方法有液相色谱法[6]。本实验基于罗丹明6G与啶酰菌胺作用发生荧光猝灭，在最佳发射波长558 nm处测得罗丹明6G荧光猝灭强度 △F与啶酰菌胺的含量成线性关系，建立了测定啶酰菌胺含量的新方法。用该方法测定茄链格孢菌对啶酰菌胺吸收量来判断茄链格孢菌对啶酰菌胺的敏感性，与传统方法测得的抑制率比较无显著性差异。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂与材料

RF-5301PC荧光分光光度计(日本，岛津(苏州)公司)；FA22048电子天平(上海精密科学有限公司)；KQ-400KDE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)。

啶酰菌胺溶液：准确称取0.0100 g啶酰菌胺(国药集团化学试剂有限公司)，溶解后定容到100 mL的容量瓶中，得100 μg/mL储备液，工作液为10 μg/mL；罗丹明6G溶液：准确称取0.0479 g罗丹明6G(天津市光复精细化工研究所)，溶解后将其定容到100 mL的容量瓶中，得1.0×10-3mol/L的储备液，工作液为1.0×10-7mol/L；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液：准确称取0.00364 g CTAB(天津市光复精细化工研究所)，溶解后定容到100 mL的容量瓶中，得1.0×10-4mol/L储备液，工作液为1.0×10-5mol/L；理察氏液体培养基：准确称取2.500 g MgSO4·7H2O、0.0200 g FeCl3·6H2O、10 g KNO3、2.5 g K2HPO4和50 g蔗糖,用蒸馏水定容到1 000 mL容量瓶中；实验所用其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

茄链格孢菌(Alternariasolani)由忻州师范学院生物系微生物实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1啶酰菌胺的测定方法在两支10 mL比色管中，依次加入1.0×10-7mol/L罗丹明6G溶液1 mL，1.0×10-5mol/L CTAB溶液 1.5 mL，1.0×10-5mol/L H2SO41 mL，其中一支加入10 μg/mL啶酰菌胺溶液1 mL，另一支不加，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。室温下放置20 min，用1 cm 比色皿，在激发波长530 nm、发射波长558 nm下测量荧光强度，分别为F、F0，计算△F(△F=F0-F)。

1.2.2茄链格孢对啶酰菌胺吸收量的测定方法取5个250 mL洁净的锥形瓶，向其中各加入100 mL理察氏液体培养基，接相同的敏感茄链格孢菌饼，置于28 ℃ 160 r/min的摇床内培养3 d。将培养后得到的液体分别加入100 μg/mL 的啶酰菌胺10、20、30、40、50 mL，放置30 min后，分别取1 mL溶液，按1.2.1方法测定啶酰菌胺的含量c，加入啶酰菌胺的浓度为c0，计算吸收量△c=c0-c。

1.2.3抑制率的测定[7]取6个250 mL的锥形瓶，依次加入等量的理察氏液体培养基100 mL,分别加入100 μg/mL的啶酰菌胺溶液0，10、20、30、40、50 mL后，在高压蒸汽灭菌锅中灭菌2 h,取出在无菌操作台中冷却到室温，分别接种等量茄链格孢菌，放入摇床中培养3 d后取出，抽滤，称重M、挑菌丝、烘干至恒重、称重m，菌丝重量(g)=M-m-纸的重量。计算抑制率：抑制率=(对照的重量—处理的重量)/对照的重量。

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

图1 不同体系的荧光光谱图Fig.1 The fluorescence spectra of the different systems 1：CTAB+rhodamine 6G;2：CTAB+rhodamine 6G+H2SO4;3：rhodamine 6G;4：rhodamine 6G+H2SO4+boscalid;5：CTAB+rhodamine 6G+boscalid+H2SO4;6：CTAB. condition:1.0×10-5 mol/L CTAB 1 mL，1.0×10-7 mol/L rhodamine 6G 1 mL,10 μg/mL boscalid 1 mL,1.0×10-5 mol/L H2SO4 1 mL.

按照实验方法，以530 nm为激发波长，558 nm为发射波长，不同体系的荧光光谱如图1。比较图中曲线1和曲线2，说明H2SO4只提供酸性环境；图中曲线2和曲线3说明CTAB的加入增加了罗丹明6G的荧光强度；图中曲线4说明啶酰菌胺对罗丹明6G的荧光具有猝灭作用；图中曲线5说明加入表面活性剂后，荧光猝灭作用增大。实验选择测定波长为558 nm。

2.2 表面活性剂的选择

按1.2.1的实验方法，固定其它条件不变，分别试验了表面活性剂十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠和CTAB。实验结果表明，CTAB的增敏效果最好，可使啶酰菌胺荧光猝灭的△F增大。实验选择加入1.0×10-5mol/L CTAB 1.5 mL。

2.3 酸度的影响

按实验方法，固定其它条件不变，分别在pH为5、6、7、8、9的条件下测定△F，结果表明pH=6时，△F最大。

2.4 反应时间和温度的影响

固定其它条件不变，改变反应时间进行实验，时间分别为10、15、20、25、30、35 min，结果表明反应时间为20 min时△F最大。

2.5 干扰实验

2.6 标准曲线与检出限

以啶酰菌胺系列标准溶液的△F值对其浓度c绘制标准曲线，其线性回归方程为：△F=168.05c-80.702,R2=0.9963,线性范围为0.1～4.0 μg/mL。利用3Sb/K公式求得检出限为2.9×10-5μg/mL。

2.7 培养基中啶酰菌胺的测定

2.7.1产生抗药性时间的探究取6个250 mL的锥形瓶，按1.2.2的实验方法，固定其它条件不变，分别实验了放置时间为10、20、30、40、50、60 min。结果表明：在同种菌类体中加入同浓度的啶酰菌胺，随着时间的延长，荧光强度先增强，说明啶酰菌胺的量开始减少，30 min后荧光强度减弱，说明啶酰菌胺浓度增强，菌类对啶酰菌胺的作用减弱，并且代谢产生了啶酰菌胺，说明30 min为菌类和啶酰菌胺作用的最佳时间。

2.7.2吸收量和抑制率的测定按1.2.1的实验方法，取培养好菌的6个锥形瓶，分别依次加入100 μg/mL的啶酰菌胺溶液10、20、30、40、50 mL,放置30 min，在558 nm波长下测定荧光强度，与不加啶酰菌胺的作对比，并计算它们的△F值，计算啶酰菌胺的吸收量;按1.2.3的实验方法分别依次加入100 μg/mL的啶酰菌胺溶液0、10、20、30、40、50 mL,培养3 d，称量菌丝的重量，计算抑制率，结果见表1。