有机相温敏性脂肪酶催化剂的结构和催化特性

雍有，朱晶莹，卢滇楠，戈钧，刘铮



有机相温敏性脂肪酶催化剂的结构和催化特性

雍有，朱晶莹，卢滇楠，戈钧，刘铮

（清华大学化学工程系，工业生物催化教育部重点实验室，北京100084）

采用不同链长PEO嵌段的Pluronic分子P123、P105、F127及F108，将其端羟基氧化为醛基，使其与脂肪酶CALB的氨基反应形成纳米结合物。TEM分析结果显示CALB-Pluronic结合物在甲苯中呈现直径为20～40 nm的纳米颗粒。所形成的CALB-Pluronic结合物在4-甲基-2-戊酮中呈现温度响应性，降低温度可使酶催化剂沉淀出来，结合物中的Pluronic高分子PEO嵌段越长，其最低临界共溶温度（LCST）越高。采用甲苯为溶剂、正丁醇及正己酸为底物，37℃下的催化实验结果显示CALB-Pluronic纳米结合物比天然CALB的表观活性提高4～6倍，而反应结束后可通过降温回收酶催化剂，显示出脂肪酶-Pluronic纳米结合物在有机相酶催化中的良好应用前景。

生物催化；酶；纳米粒子；有机相酶催化；嵌段聚醚；温敏性高分子；酶-高分子结合物

引 言

脂肪酶可以催化酯水解、酯交换、酯合成等多种反应，研究用于有机相合成的具有良好酯化功能的脂肪酶催化剂对于酶催化合成精细化学品和手性化合物具有重要意义[1-3]。然而，脂肪酶在非极性有机溶剂如甲苯中的催化活性很低，致使反应速率过慢而失去实用价值。这主要是由于：① 酶分子不溶于非极性有机溶剂，故而呈现为聚集体颗粒形态，这使得底物接触酶活性中心的难度增大；② 酶分子在非极性溶剂中的结构刚性增强，进一步导致催化活性降低[4-7]。传统的固定化方法是将酶固定于载体之上，这能够提高酶在有机溶剂中的稳定性，然而因为传质速率的限制，酶在有机相中的催化活性仍然很低[8]。为提高酶在有机相中的催化活性，有学者提出了溶剂工程[9]、底物印迹[10]、纳米生物催化[11]等方法。在纳米生物催化方面，如纳米硅颗粒[12]、纳米花[13]、高分子纳米凝胶[14]、高分子-酶结合物[15]等纳米酶催化剂能够显著提升酶的各项性质。

近期Zhu等[16]提出了一种将有机相温敏性高分子Pluronic与酶分子偶联形成纳米结合物的方法，该方法可使酶催化剂很好地分散于甲苯等非极性有机溶剂中，便于底物接触到酶活性位点，使得酶催化剂的有机相表观活性提高1～2个数量级。反应结束则可以降低温度，使得酶-Pluronic高分子结合物沉淀出来，通过离心加以回收。酶-Pluronic结合物经历反复的升温和降温处理，其表观活性保持不变。酶-Pluronic结合物的上述优点使其在有机相酶催化中具有很好的应用前景。Zhang等[17]采用该种酶-Pluronic结合物在4-甲基-2-戊酮(MIBK)中催化合成了抗肿瘤药物戊柔比星(Valrubicin)。相比天然酶，酶-Pluronic结合物的催化活性和对产物的选择性都有大幅度的提高。

Pluronic是BASF公司生产的一类聚氧乙烯聚氧丙烯三嵌段共聚物，其分子式可表示为EO-PO-EO，调整其EO和PO的组成，所得到的聚合物便可具有不同的结构及温度响应特性[18]，这为其应用于构筑不同类型的酶催化剂提供了丰富的可能[19-20]。本工作以南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）为样品酶，采用不同PEO嵌段长度的Pluronic制备CALB-Pluronic纳米结合物，研究PEO嵌段长度对结合物的结构、表观催化活性以及温度响应性的影响规律，为此类有机相温敏性酶催化剂的设计和应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

Pluronic P123、Pluronic F127、Pluronic F108、脂肪酶lipaseB（CALB）等购自Sigma-Aldrich，USA。Pluronic P105购自武汉新大地环保材料有限公司。戴斯-马丁氧化剂购自Adamas, China。氰基硼氢化钠、磷钨酸钠、4-氨基- 3-肼-5-巯基-1,2,6-三唑（Purpald）、高碘酸钠、甲醛、甘氨酸等购自Alfa Aesar, USA。十二烷基磺酸钠（SDS）、丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、次高分子量标准蛋白等购自北京拜尔迪公司。磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、二氯甲烷、乙醚、甲苯、四氢呋喃、四硼酸钠等购自国药集团化学试剂有限公司。二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自北京赛驰生物科技有限公司。所有试剂均直接使用。

1.2 分析方法

采用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度，标准蛋白为牛血清白蛋白，用酶标仪（Tecan Sunrise，Switzerland）测定560 nm吸光度。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）使用北京君意东方电泳设备有限公司JY300C电源供应器及JY-SCZ2+电泳槽。结合物分散在有机溶剂中的形貌通过透射电子显微镜（Hitachi，H-7650B，Japan）观察。

采用TNBS法测定结合物的氨基修饰率。用100 mmol·L-1、pH 9.3的硼酸缓冲液配制浓度为0.01～0.1 mmol·L-1甘氨酸标准溶液及适宜浓度的待测蛋白或结合物溶液。分别取1 ml样品加入3ml 5%TNBS溶液，30℃下避光处理2 h，测定各样品在420 nm的吸光度值。通过对比反应前后蛋白溶液的吸光度，可计算氨基修饰率。

1.3 CALB-Pluronic结合物的制备

将2 g Pluronic溶解到100 ml二氯甲烷中，加入戴斯-马丁氧化剂（其物质的量为Pluronic的5倍），室温搅拌12 h，得到浑浊反应液。过滤除去不溶物（为戴斯-马丁氧化剂的还原产物），将滤液旋蒸到剩余适量黏稠液体。对于Pluronic P123，因其为液态及膏状物质，无法通过乙醚沉淀，旋蒸后剩余液体直接置于真空烘箱中干燥12 h得到端基修饰产物。对于其他系列Pluronic，加入100 ml冷乙醚，沉淀得到大量白色沉淀，于冰水浴中静置1 h，过滤后再用冷乙醚洗涤沉淀，置于真空烘箱中干燥12 h备用。

用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10 mmol·L-1，pH 7.0）分别配制CALB溶液和端醛基Pluronic溶液，再混合，控制混合溶液中CALB的浓度为2 mg·ml-1，醛基与蛋白氨基（以蛋白表面氨基数计算）的摩尔比为1.1:1，室温搅拌反应2 h。加入Pluronic 质量的10%的氰基硼氢化钠（预溶解在少量水中再加入），继续室温搅拌反应12 h。反应后的溶液在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10 mmol·L-1，pH 7.0）中透析24 h。由于Pluronic L121在水中溶解度较差，配制溶液时加入少量四氢呋喃帮助溶解。

1.4 CALB-Pluronic结合物的分析和表征

结合物在有机溶剂中的形貌通过透射电子显微镜（Hitachi，H-7650B，Japan）观察。将结合物分散到甲苯中，蛋白浓度为1mg·ml-1。在碳膜上滴加10ml样品，等待45 s使甲苯挥发，并用滤纸吸去多余的样品。滴加浓度10 g·L-1[1% (w/v)]、pH 7.0 的磷钨酸钠水溶液，60 s后除去碳膜表面多余溶液，室温干燥后置于透射电子显微镜上观察。

1.5 脂肪酶及其结合物的酶活测定

脂肪酶及其结合物在水相中的水解酶活采用对硝基酚酯（对硝基苯酚乙酸酯，对硝基苯酚丁酸酯，对硝基苯酚辛酸酯，对硝基苯酚棕榈酸酯）作为底物测定。首先配制含有12.5 g·L-1[1.25%(w/v)] Triton X-100 的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液 (50 mmol·L-1，pH 7.0)，在搅拌下缓慢加入溶解了对硝基酚酯的丙酮溶液，配制成0.5 mmol·L-1的底物溶液，终溶液中丙酮体积分数为 5%。测酶活时，将50ml 0.05 mg·ml-1酶液加到950ml底物溶液中，混合3 s后，在紫外可见分光光度计（SHIMADZU UV 2450，Japan）上测定1 min内 348 nm 处的吸光度值的动态变化。

采用正己酸和正丁醇作为底物测定脂肪酶CALB及其结合物在甲苯中的酶活。配制5 ml底物的甲苯溶液，正己酸和正丁醇浓度均为0.1 mmol·L-1，在40℃、200 r·min-1摇床中平衡15 min，加入冻干天然酶粉或结合物（蛋白含量为0.5 mg），反应15 min后加入10 ml乙醇/丙酮（体积比1:1）混合液终止反应，用0.05 mol·L-1氢氧化钠溶液滴定剩余正己酸的量，从而计算酶活。

2 实验结果与讨论

2.1 结合物的结构分析及表征

采用1.3节所述的合成方法，首先对PluronicP123、P105、F127及F108进行端醛基修饰，然后偶联CALB,得到相应的CALB-Pluronic结合物。亲水亲油性（HLB）由高分子的亲水程度决定，HLB值越低则高分子疏水性越强。Pluronic P123、P105、F127及F108具有相近长度的疏水PPO嵌段和依次增长的亲水PEO嵌段，其HLB值分别为8、15、22、27（表1）。

表1 Pluronic的化学组成和亲水亲油性Table 1 Chemical compositions and HLB values of Pluronics

使用还原性的SDS-PAGE表征结合物，天然酶条带显示为38×103（图1），结合物在更高分子量处出现连续条带。与Pluronic反应后天然酶的条带消失，由此可确定天然酶与Pluronic形成结合物。通过测定氨基修饰率可知结合物中每个CALB约与3～8个Pluronic分子相结合。

A—protein molecular weight marker; B—CALB; C—P123-CALB; D—P105-CALB; E—F127-CALB; F—F108-CALB

将上面所得结合物在40℃下分散于甲苯、4-甲基-2-戊酮（MIBK）等有机溶剂中。使用透射电镜（TEM）表征PluronicP123-、P105-、F127-、F108-CALB结合物在甲苯中分散的形貌，结果如图2所示，可以看出结合物在常温下聚集成粒径在20～40 nm之间的纳米颗粒。

2.2 结合物的催化活性

采用2.5节所述的方法测定PluronicP123-、P105-、F127-及F108-CALB结合物和天然CALB在水相中的活性，结果如图3所示。由图可知，与天然CALB相比，PluronicP123-、P105-、F127-及F108-CALB结合物的活性分别为113.0%、147.0%、63.2%及95.4%。

由图3的结果可以看出Pluronic分子的组成和结构对于所得到的脂肪酶结合物的活性存在显著的影响。在本研究所涉及的4种Pluronic高分子中，P105-CALB结合物的水相活性最高，而要探讨其中的原因，则需进一步通过分子模拟和结构分析揭示偶联高分子后对于底物摄取、产物传递以及酶活性位点结构的影响机制。偶联P105使得表观活性提高的实验结果显示出通过化学方法强化酶催化活性的可能性。

采用1.5节所述的方法测定了Pluronic-CALB结合物和天然CALB在甲苯中催化正丁醇和正己酸的酯化反应的活性，结果如图4所示。

由图4可以看出，Pluronic P123-、P105-、F127-、F108-CALB结合物在甲苯中的催化活性为天然CALB的596%、440%、429%以及580%，换言之，结合物在甲苯中的表观活性比天然酶提高了4～6倍。究其原因，由图2可知，上述Pluronic-CALB结合物在甲苯溶液中均能够呈现为纳米级的分散，这样就有利于底物接触到酶催化活性位点而发生反应。反之，天然CALB因为不溶于甲苯而呈现为肉眼可见的宏观聚集体状态，这对于其与底物的接触和催化是不利的。同样，这里不同结构的Pluronic分子对于脂肪酶表观催化活性的提升效果存在差异，疏水性越强的 Pluronic 分子越有利于酶催化剂在甲苯中的分散，所呈现的表观活性就越高。界面活化效应[21]是脂肪酶活性的影响因素之一，疏水微环境能够提升脂肪酶活性。实验表明，更加疏水的Pluronic P123-、P105-CALB在水相和有机相中都具有更高的催化活性。但Pluronic的选择还应考虑其偶联酶的收率和回收特性。

2.3 结合物在有机相中的温敏性

将2.5 mg结合物冻干粉末溶解于1 ml 4-甲基- 2-戊酮中，转移到比色皿中，在紫外可见分光光度计（SHIMADZU MutiSpec1501，Japan）上测定550 nm处的吸光度变化。通过恒温水浴（宁波天恒仪器厂，DC-2006）控制温度改变，其温度控制范围为5～40℃，每个温度点稳定5 min后测定。研究表明，Pluronic F127-CALB结合物在甲苯及MIBK中表现出温度响应性，4℃下能够从溶剂中析出使溶剂浑浊，并引起吸光度改变。将Pluronic P123-、P105-、F127-、F108-CALB结合物在40℃下分散于MIBK溶剂中，并于-4℃静置存放，均可观察到溶剂浑浊及吸光度改变。通过逐步降温法测定Pluronic P123-、P105-、F127-、F108-CALB结合物在MIBK中溶液的吸光度，得到Pluronic F127及F108-CALB的临界最低共溶温度（LCST）分别为20、15℃。Pluronic P123-、P105-CALB在常温下不发生沉淀，但在-4℃保温24 h后会发生沉淀，表明其具有温度响应性，但其LCST有待准确测定（图5）。

■Pluronic P123-CALB; ●Pluronic P105-CALB;▲Pluronic F127-CALB; ▼Pluronic F108-CALB

综合分析，Pluronic F127-脂肪酶结合物在有机相中的析出温度最高，这有利于降温回收结合物。结合物的温度响应特性主要由结合物的亲疏水性决定，亲水性强的结合物在有机相中对温度变化更加敏感而更易析出，疏水性强的结合物在有机相中分散性好而难以析出。在选择高分子来制备Pluronic- CALB结合物时，应兼顾酶催化活性和温度响应特性两个因素，以提高酶催化过程的综合效益。

3 结 论

考察了高分子PEO嵌段长度对Pluronic–脂肪酶结合物催化活性及温敏性的影响。结构表征结果表明结合物在有机相中以20～40 nm的纳米颗粒的形式存在；CALB-Pluronic结合物在有机相中的酶活较天然酶提高4～6倍，表观活性与Pluronic中 PEO嵌段长度相关，PEO嵌段越短则在有机相中的分散性越好，催化活性高。温敏性实验表明疏水性较强的结合物在有机相中溶解性能更好；亲水性较强的结合物则具有更好的温度响应性，更易于通过降温析出。上述结构和催化特性的研究结果对于此类有机相温敏性酶催化剂的设计及应用具有有益的依据和参考。

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Structural and catalytic characteristics of temperature-responsive lipase catalyst in organic solvents

YONG You, ZHU Jingying, LU Diannan, GE Jun, LIU Zheng

（Key Laboratory for Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China）

Pluronic polymers P123, P105, F127 and F108, which have different chain lengths of PEO block were modified to generate aldehyde terminals for the conjugation with surface amine groups of CALB. The resulted Pluronic-CALB conjugates were characterized by SDS-PAGE and transmission electron microscopy. It was showed that the conjugates were dispersed well in toluene and appeared as nanoparticles with diameters ranged from 20 nm to 40 nm. The conjugates can be dispersed in methyl isobutyl ketone (MIBK) with temperature- responsive properties. The conjugate with a longer chain length of PEO block appeared a higher low critical solution temperature (LCST). The apparent activity of the conjugates in toluene at 37℃ was increased by 4 to 6 folds compared to the native counterpart. The recovery of CALB conjugates can be accomplished by precipitation at low temperature, making this enzyme conjugate suitable for industrial enzymatic synthesis in organic media.

biocatalysis; enzyme; nanoparticles; enzymatic catalysis in organic media; block polyether; temperature-responsive polymer; enzyme-polymer conjugate

2015-01-16.

Prof. LIU Zheng, liuzheng@mail.tsinghua.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (21036003, 21206082).

10.11949/j.issn.0438-1157.20150068

TQ 028.8

A

0438—1157（2015）07—2534—06

国家自然科学基金项目（21036003, 21206082）。

2015-01-16收到初稿，2015-03-30收到修改稿。

联系人：刘铮。第一作者：雍有（1993—），男，博士研究生。