CeO2的制备、表征及对PC12细胞氧化损伤的保护作用

刘纯青，申林林，栾 艺，刘 娜

(1.大连医科大学 检验医学院，辽宁 大连 116044； 2.大连医科大学 2010级七年制7班， 辽宁 大连 116044； 3.大连医科大学 2011级医学检验3班， 辽宁 大连 116044)

论 著

CeO2的制备、表征及对PC12细胞氧化损伤的保护作用

刘纯青1，申林林2，栾 艺3，刘 娜1

(1.大连医科大学 检验医学院，辽宁 大连 116044； 2.大连医科大学 2010级七年制7班， 辽宁 大连 116044； 3.大连医科大学 2011级医学检验3班， 辽宁 大连 116044)

目的 制备纳米氧化铈(nanoceria，CeO2)，初步探讨其对肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12氧化损伤的保护作用。方法 采用均相沉淀法制备纳米CeO2，对其晶粒大小和晶粒形貌进行表征。将粗浓度为250 mmol/L的CeO2加入PC12细胞培养液，通过20 μmol/L H2O2诱导细胞损伤，建立PC12细胞的氧化应激损伤模型，采用MTT法检测对照组、CeO2组、CeO2+H2O2组，H2O2组的细胞活性，测定CeO2对PC12细胞的保护作用。结果 采用均相沉淀的方法合成粒子直径为5～10 nm的CeO2。 MTT实验显示H2O2组细胞存活率为(74.61±3.97)%，CeO2+H2O2组的细胞存活率为(99.21±4.01)%，明显高于H2O2组(P<0.05)。结论 CeO2对H2O2造成的氧化损伤细胞具有保护作用。

CeO2；制备；PC12细胞；抗氧化损伤

由于纳米氧化铈(nanoceria，CeO2)具有独特的氧化还原性能，在稀土氧化物系列中具有较高的催化活性，因此受到各国科学家的极大关注。目前CeO2及其复合材料已成功用于汽车尾气的催化净化。由于铈元素具有特殊的电子结构，可随环境的变化而从Ce4+变价到Ce3+，在生物环境中具有抗氧化作用，因此在氧化应激所导致的衰老、肿瘤和神经退行等多种疾病的防治中具有重要作用[1-3]。氧化应激导致的神经退行疾病在西欧、北美的发病率是世界年均发病率的10倍，CeO2作为抗氧化剂在生物医学中的应用备受国内外学者的关注[4-5]。目前，中国也将面临着人口老龄化的问题，神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病和帕金森病正在迅速地增加，研究CeO2对氧化应激细胞损伤的保护作用具有极其重要的意义和良好的应用前景。PC12细胞是从大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆的细胞株，常用于分析神经元分化和神经毒理作用的研究。

本实验旨在研究所制备的CeO2的结构和生物学功能，及其对体外H2O2损伤PC12细胞的生物保护作用进行初步探讨。

1 材料和方法

1.1 均相沉淀法制备CeO2

将含有0.1 mol硝酸铈铵和3 mol尿素的混合溶液在搅拌下加热煮沸，使其充分反应；将沉淀过滤后用去离子水反复洗涤后烘干，得到CeO2前驱体。将上述方法制得的样品前驱体在773K马弗炉中焙烧2 h，得到CeO2。称取1.723 g CeO2，分散于PBS溶液中超声30 min，制得粗浓度为250 mmol/L的PBS-CeO2液，采用滤膜过滤除菌后，液体备用。用电感耦合等离子体-原子发射光谱法(ICP-AES)对CeO2的浓度进行定量测定。

1.2 CeO2表征

CeO2物相是在RINTD/MAX-2500PC型X射线衍射仪(XRD)上测定，采用Cu Kα射线源，管压40 kV，管流100 mA，扫描速度5°/min，测量范围2θ=20°～65°，步长为0.02。根据谢乐(Scherrer)方程计算CeO2晶粒的大小：

d=0.89λ/βcosθ

(1-1)

其中d为粒子的平均粒径，λ=0.154056 nm，为X射线波长，θ为三强峰衍射角的半角，β为半峰宽(弧度值)。

采用JEOL(日本电子株式会社)JEM-2000EX透射电镜(TEM)对粉体的颗粒大小进行观测。首先将样品在乙醇溶液中超声分散，然后取悬浮液滴在镀碳膜的铜网上，待乙醇在空气中自然挥发后，在透射电镜下观测样品颗粒的大小及形貌。

1.3 细胞培养

PC12 细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株)由中科院上海细胞库引入，培养于10%灭活的胎牛血清和5%灭活马血清的高糖含丙酮酸钠的DMEM培养基中，于37 ℃，5%CO2条件下培养。隔天换1次液，待细胞均匀生长于培养瓶5d左右传代1次，用胰酶消化，传代培养。待细胞形成神经突起，交织成网络，分化成为神经元样细胞后，选取对数生长期细胞做实验。

1.4 MTT实验

取对数生长期的PC12细胞，以5×104/mL密度，每孔200 μL接种于96孔细胞培养板。CeO2+H2O2组种植后48 h先以粗浓度为250 mmol/L PBS-CeO2处理PC12细胞24h，在此基础上再给予20 μmol/L H2O2处理细胞30 min, 后弃去培养液，再次换上含有PBS-CeO2的新培养液继续处理24h。之后，每孔加入MTT 10 μL，4h后小心吸去孔内液体，加入100 μL DMSO，充分振荡10 min，酶标仪570 nm波长下测定光密度(OD)。PBS-CeO2或H2O2单独给药组及对照组给予上述相同处理，以PBS代替药物，每个处理组设置6个复孔，取平均值作为本次实验结果。各组平均吸光度需减去空白对照吸光度(不含细胞)，计算各组细胞存活率(实验组吸光度/对照组吸光度)，上述实验重复3次，进行各组间差异的统计分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件包处理数据。实验结果以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析(F检验)，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 XRD谱图

测样品均形成了均一的CeO2，见图1。采用谢乐公式计算样品的粒径大小为9.2 nm。

图1 CeO2的XRD谱图

2.2 TEM表征

TEM下，CeO2样品的颗粒呈球形，且粒径分布基本均匀，颗粒尺寸范围为5～10 nm。见图2。

图2 CeO2样品的TEM照片

2.3 CeO2对H2O2氧化损伤PC12细胞存活率的影响

H2O2组的细胞存活率与对照组相比，差异有显著性意义(P<0.05)；CeO2+H2O2组的细胞存活率与H2O2组相比，差异有显著性意义(P<0.05)。见表1。

表1 CeO2对H2O2氧化损伤PC12细胞存活率的影响

3 讨 论

2006年McGinnis等将CeO2纳米颗粒注入小鼠眼中，发现这种化合物能保护小鼠的视网膜免受照明的损伤。如果在损伤后再注入这种化合物，还可使眼睛痊愈。这主要是基于CeO2纳米颗粒具有抑制活性氧的功效。McGinnis等进一步报告CeO2作为抗氧化剂在生物医学中的合成和潜在的应用，并认为由于CeO2特殊的氧化还原性能，使得其在应用中具有一次给药长期有效的特点[1]。研究表明导致神经退行性病变的原因之一就是氧化应激，活性氧增加。神经元对ROS攻击特别敏感，ROS过量，神经系统的结构与功能受到破坏。CeO2纳米颗粒能有效抑制由活性氧导致的细胞凋亡，从而对氧化应激损伤具有较好的保护作用。2007年Singh等[2]报告CeO2在神经退行性疾病治疗中的抗氧化功效。Seal等[3]研究发现氧化铈具有单分散性，催化超氧化岐化酶活性，用于治疗因氧化应激损伤的生物组织，包括组织培养及动物细胞等，增加细胞寿命，保护细胞免受辐射损伤，促进超氧化物转化为H2O2。

本实验中，由图1 CeO2的3个特征峰可知，所测样品均形成了均一的CeO2立方晶项，采用谢乐公式计算样品的粒径大小为9.2 nm。图2的TEM照片与谢乐公式计算所得粒径大小的结果基本一致。表明采用均相沉淀法制备的CeO2具有粒度均一，粒径大小在5～10 nm左右。本实验发现CeO2基本不影响细胞的正常生长，细胞存活率为(101.75±3.16)%，具有细胞相容性，而H2O2氧化损伤对细胞有显著的损伤作用，CeO2对H2O2造成的氧化损伤具有保护作用。这与其他研究者在不同的研究体系中得到的结论相似。

在生物医学领域中，已报告的CeO2研究主要用到的细胞模型为βTC-tet，BT474，A549，诱导的BEAS-2B和J774A，HT22等[6-8]。Jakupec等[9]研究认为CeO2之所以有生物学活性的一个主要原因是由于Ce3+和Ca2+的离子半径接近，因而有可能部分替代钙离子而表现其生物学活性。研究发现CeO2具有抑菌，杀菌和抗癌抗菌等功能。文献报告及本研究的实验结果均表明CeO2在医药方面有很好的应用前景[10-11]，但铈基氧化物对生物体的影响仍需要作进一步深入的探讨。

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Preparation, characterization of nanoceria and its protection on oxidative damage of PC12 cells

LIU Chun-qing1, SHEN Lin-lin2, LUAN Yi3, LIU Na1

(1.CollegeofMedicalLaboratory,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 2.DepartmentofClinicalMedicineinSeven-yearof2010Grade，DalianMedicalUniversity,Dalian116044，China; 3.MedicalLaboratoryof2011Grade，DalianMedicalUniversity,Dalian116044，China)

Objective To prepare nanoceria (CeO2) and to investigate the protective effect on oxidative damage of Pheochromocytoma cell (PC12). Methods Homogenous precipitation method was used to prepare the nanoceria. XRD and TEM were used to characterize and determine the size of CeO2. 250 mmol/L rough concentration of CeO2was added into PC12 cell culture fluid. Cells were induced and damaged by 20 μmol/L H2O2. And oxidative stress damage model of PC12 cell was set up. The cell survival rate of control group, CeO2+H2O group and H2O2group was measured by MTT method, respectively. The antioxidative protection of CeO2to the PC12 damaged by H2O2was evaluated. Results The size of nanoceria was 5-10 nm. According to the results of MTT method, it was shown that the cell survival rate of H2O2group was (74.61±3.97)%. And the cell survival rate of CeO2+H2O group was (99.21±4.01)%, which was significantly higher than H2O2group (P<0.05). Conclusion Nanoceria would have the protective effect on the PC12 which was oxidative damaged by H2O2.

nanoceria; preparation; PC12 cells; antioxidative damage

10.11724/jdmu.2015.06.02

国家自然科学基金项目(31100772)；辽宁省大学生创新创业训练计划项目(2015)

刘纯青(1975-)，女，辽宁大连人，副教授。E-mail：liuchunqing2008@hotmail.com

刘 娜，副教授。E-mail：1619205853@qq.com

TQ462+91

A

1671-7295(2015)06-0526-03

刘纯青，申林林，栾艺，等. CeO2的制备、表征及对PC12细胞氧化损伤的保护作用[J].大连医科大学学报，2015,37(6)：526-528.

2015-07-17;

2015-10-20)