茯苓多糖的结构改性及抗氧化活性研究

陈小红等

摘要：研究中药茯苓（Poria cocos）多糖的羧甲基化和阿魏酸结构改性，并对其进行了体内、体外的抗氧化性能测定。红外吸收光谱图结果显示两者改性获得成功。在一定的浓度范围内，两者均具有一定的还原能力和抗氧化能力，且其还原能力、清除能力均表现出与样品浓度有明显的量效关系，达到一定浓度后趋于稳定。FP（阿魏酸茯苓多糖）的抗氧化性能要强于CMP（羧甲基茯苓多糖），但均弱于抗坏血酸，CMP、FP对·O2-清除作用均弱于对·OH的清除作用。

关键词：茯苓（Poria cocos）；多糖；结构改性；抗氧化

中图分类号：S567.3+2；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4563-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.043

茯苓（Poria cocos）是中国传统的名贵药材，其具有安神、健脾、和胃、利尿、渗湿等功能[1]。茯苓多糖是茯苓的主要活性成分，主要结构为β-（1→3）-D-葡聚糖[2]。经研究，茯苓多糖本身生物活性较低，且不溶于水，难以进行有效的利用，必须对其进行化学修饰的结构改性以提高活性[3]。目前国内外报道研究较多的是茯苓多糖羧甲基化的结构改性，而对其他的结构改性特别是改性后的各种生物性能（如抗氧化等）研究较少[4]。因此，为了全面系统研究茯苓多糖各种结构改性的抗氧化性能，试验通过茯苓多糖的羧甲基化和阿魏酸结构改性，并进行两者体内、体外的抗氧化性能比较，揭示两者之间抗氧化性能的差异性，以期为茯苓多糖的进一步开发利用，特别是在化妆品、保健品及中医药领域的产品研制与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

市场购买茯苓，粉碎，过 200目筛，经稀碱提取、高碘酸钠氧化、酸水解、干燥获得茯苓多糖[5]；昆明种健康小鼠，雌雄各半，体重（19±2） g，由龙岩市第二医药检验科提供，试验前各小鼠先适应性喂养5～7 d。

检测试剂盒：SOD（超氧化物歧化酶）和MDA（脂质过氧化产物丙二醛）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

主要仪器：YF-103型便捷式高速中药粉碎机、岛津IR-400型红外光谱仪、UV-2 000型紫外可见分光光度计、86-2型磁力加热搅拌器。

1.2 方法

1.2.1 茯苓多糖的结构改性 羧甲基茯苓多糖：采用二次碱化法，将茯苓多糖用 95%乙醇洗涤、搅拌 20～30 min，加入一定量的固体氢氧化钠剧烈搅拌 30～45 min 为第一次碱化；然后在 50 ℃ 水浴中加入一定量的一氯乙酸反应 2.5 h， 再加入少量的氢氧化钠和去离子水继续反应为第二次碱化；最后再用乙酸中和至pH 5.0～6.0，依次再用80%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤3～4次，透析，冷冻干燥，得羧甲基茯苓多糖（Carboxymethyl pachymaran，CMP）。阿魏酸茯苓多糖：采用直接酯化法，将茯苓多糖用二甲基亚砜溶解，80 ℃剧烈搅拌 20～30 min 后加入与多糖等同质量的阿魏酸试剂和一定量的甲苯溶液进行反应，时间 4 h，温度90～95 ℃；反应结束后自然冷却，再用氢氧化钠中和至pH 7.0～8.0，抽滤，依次再用乙醇∶醋酸=70∶30溶液、80%乙醇、无水乙醇洗涤3～4次，透析，冷冻干燥，得阿魏酸茯苓多糖（Pachymaran ferulate，FP）。以原茯苓多糖为对照，在相同条件下测定CMP、FP的红外吸收光谱图[6]，分析其结构变化，确定原茯苓多糖羧甲基化、阿魏酸化是否改性成功。

1.2.2 CMP、FP还原能力的测定 还原能力的高低在一定程度上反映了药物抗氧化性能，还原能力越强，抗氧化能力越强[7]。分别将CMP、FP配置成0.1～5 g/L的多糖溶液，各取1 mL按照Oyaizu[8]的方法测定其还原能力，试验同时以抗坏血酸为对照，比较三者之间还原能力。试验均重复3次取均值。

1.2.3 CMP、FP总抗氧化活性的测定 采用三价铁还原/抗氧化能力分析（FRAP）法。分别将 CMP、FP 配置成5 g/L的多糖溶液，37 ℃水浴反应10 min，测定OD593 nm，以 1.0 mmol/L FeSO4·7H2O为标准品做标准曲线，样品总抗氧化活性以达到同样吸光度所需的 FeSO4·7H2O的毫摩尔数表示，试验同时以抗坏血酸（VC）为对照，比较三者之间的总抗氧化活性。

1.2.4 CMP、FP羟自由基清除率的测定 按照 Fenton反应原理，具有抗氧化作用的物质能与水杨酸竞争反应。分别将CMP、FP配置成0.5～5 g/L的多糖溶液，在反应体系中依次加入硫酸亚铁、水杨酸、1 mL 各样品溶液、H2O2，在37 ℃水浴中反应30 min，测OD510，以不同浓度的样品溶液对·OH的清除率作图。试验同时以抗坏血酸为对照，比较三者之间·OH 的清除能力。清除率=[A无样品溶液-（A样品溶液-A样品本底颜色）]/A无样品溶液×100%。

1.2.5 CMP、FP超氧自由基（·O2-）清除率的测定 按照邻苯三酚自氧化反应原理，具有抗氧化作用的物质能对·O2- 产生抑制作用。分别将CMP、FP配置成1～5 g/L的多糖溶液，在 Tris-盐酸 pH 8.2 反应体系中依次加入0.5 mL各样品溶液、邻苯三酚，在37 ℃水浴中反应5 min，浓盐酸终止反应，测OD320，以不同浓度的样品溶液对·OH的清除率作图。试验同时以抗坏血酸为对照，比较三者之间·O2-的清除能力。清除率=[A无样品溶液-（A样品溶液-A样品本底颜色）]/A无样品溶液×100%。

1.2.6 CMP、FP动物体内抗氧化活性测定 将240只适应性喂养后的小鼠随机分8组，3次重复，每组10只，阴性对照组（生理盐水）、CMP的低中高剂量组（100、200、400 mg/kg）、FP低中高剂量组（100、200、400 mg/kg）、阳性对照组（VC，200 mg/kg），每组均以5 mL/（kg/d）的剂量每天定时灌胃一次，连续30 d，试验结束后，小鼠空腹过夜，摘眼球取血，常规方法离心获得血清，备用。小鼠颈椎脱臼处死后，取肝脏，用预冷的生理盐水洗涤后，称重，剪碎，加生理盐水组织匀浆，离心，取上清液，备用。所得的小鼠血清、肝组织匀浆的SOD和MDA均按照试剂盒说明书方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 CMP、FP的红外吸收光谱

CMP、FP和原茯苓多糖的红外吸收光谱见图1。由图1可知，3种多糖均有糖类的特征吸收峰2 900 cm-1，且其他结构特征吸收峰基本相似，仅CMP 在1 500 cm-1左右存在羧甲基的特征吸收峰，仅FP在1 726 cm-1处存在酯的特征吸收峰，说明CMP、FP的羧甲基化、阿魏酸的结构改性成功。

2.2 CMP、FP的还原能力比较

CMP、FP和VC的还原能力比较见图2。由图2可知，CMP、FP具有一定的还原能力，随着浓度的增加，其抗氧化性能均逐渐增强，当浓度达到3.0 g/L左右趋于稳定。FP的还原能力强于CMP，但均小于VC。

2.3 CMP、FP的总抗氧化活性比较

CMP、FP和VC的总抗氧化活性比较见图3。由图3可知，CMP、FP具有一定的抗氧化性能，FP的抗氧化性能明显强于CMP，但均低于VC。

2.4 CMP、FP对·OH清除作用比较

CMP、FP和VC对·OH的清除作用比较见图4。由图4可知，CMP和FP对·OH具有一定地清除作用，随着浓度的增加，清除作用依次增强，表明CMP、FP对·OH的清除能力与样品浓度有明显的量效关系，但到达一定浓度后趋于稳定，其最大清除能力分别达到52.3%、65.6%，FP的清除能力明显强于CMP。但CMP、FP对·OH的清除能力要弱于VC，CMP、FP和VC的EC50分别为3.7、2.6、0.25 g/L。

2.5 CMP、FP对·O2-清除作用比较

CMP、FP和VC对·O2-的清除作用比较见图5。由图5可知，CMP和FP对·O2-具有一定得清除作用，随着浓度地增加，清除作用依次增强，表明 CMP、FP对·O2-的清除能力与样品浓度有明显的量效关系，但到达一定浓度后也趋于稳定，其最大清除能力分别为17.2%、32.3%，FP的清除能力要明显强于CMP。VC的EC50为0.16 g/L，CMP、FP对·O2-的清除能力要弱于VC，且均低于50%，表明CMP、FP对·O2-清除作用要弱于对·OH清除作用。

2.6 CMP、FP动物体内抗氧化作用比较

SOD能减少体内过多的自由基，保护细胞免受氧自由基的伤害，SOD活力越高，越有利于清除体内的氧自由基。MDA是氧自由基损伤组织的代谢产物，浓度越高表明机体受自由基攻击程度越严重。CMP、FP和VC动物体内SOD活性和MDA含量的影响比较见表1和表2。与阴性对照相比，CMP、FP均能提高小鼠SOD的活性，且在试验浓度范围内，随着浓度增高，SOD活性增加，表现出良好的正相关性，同剂量灌胃CMP组、FP组，CMP组在血清和肝脏中的SOD活力均小于FP组，但两组均小于VC阳性对照组。与阴性对照相比，CMP、FP均能降低小鼠MDA的含量，且在试验浓度范围内，随着浓度增高，MDA含量降低，表现出良好的负相关性，同剂量灌胃CMP组、FP组，CMP组在血清和肝脏中的MDA含量均高于FP组，但两组MDA含量均高于VC阳性对照组。试验结果表明，CMP、FP体内抗氧化效果要弱于VC，但与阴性对照相比，还是表现出了一定的体内抗氧化活性，且其抗氧化活性与其浓度高低呈正相关。与阴性对照相比，CMP、FP中剂量组（200 mg/mL）的血清、肝脏中的SOD活力、MDA含量均达到了显著差异（P<0.05），CMP、FP高剂量组（400 mg/mL）的血清、肝脏中的SOD活力、MDA含量均达到了极显著差异（P<0.01）。

3 小结与讨论

为了提高茯苓多糖的生物活性，本试验将茯苓多糖进行了羧甲基化和阿魏酸的结构改性，红外吸收的光谱图试验结果表明，两者的改性获得成功。经改性后，测定了羧甲基茯苓多糖CMP和阿魏酸茯苓多糖FP的体外和体内抗氧化性能，在一定的有效浓度范围内，两者均具有一定的还原能力和抗氧化能力，且其还原能力、清除能力均表现出与样品浓度有明显的量效关系，且达到一定浓度后趋于稳定。FP的抗氧化性能要稍强于CMP，但均弱于VC，且CMP、FP对·O2-清除作用均要弱于对·OH清除作用。体内抗氧化试验表明，CMP、FP均能在一定程度上提高小鼠血清和肝脏中SOD的活性和降低MDA含量，这对保护动物机体细胞受免疫损伤、组织受脂质过氧化损伤均有一定得益处，CMP、FP起到了一定的抗氧化作用。

多糖是自然界中发现的又一种具有抗氧化活性的成分，其机理可能是多糖分子上的半缩醛羟基具有一定的还原性能，可以与活性氧自由基发生相互作用[9]。多糖的抗氧化性能与样品浓度有明显的量效关系，但达一定浓度后趋于稳定，原因可能是多糖溶液浓度饱和后，各多糖分子之间产生互相排斥，与活性氧自由基作用能力下降，使其还原能力、对·OH、·O2-的清除能力下降[10]。阿魏酸能淬灭活性氧自由基，本身具有较强的抗氧化活性，因此阿魏酸茯苓多糖的结构修饰的抗氧化性能要强于羧甲基茯苓多糖[11，12]。

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