酱香大曲中高产蛋白酶功能细菌的筛选及鉴定

王　婧，王晓丹，3，罗晓叶，邱树毅，肖　蓓，张小龙，胡鹏刚*

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；3.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

酱香大曲中高产蛋白酶功能细菌的筛选及鉴定

王婧1，2，王晓丹1，2，3，罗晓叶1，2，邱树毅1，2，肖蓓1，2，张小龙1，3，胡鹏刚1，2*

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；3.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

通过对酱香型大曲中的细菌进行分离纯化培养，获得一株高产蛋白酶的菌株FBKL1.0199，然后采用菌株形态学观察、生理生化实验和分子生物学方法，鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。实验条件下该菌株所产中性蛋白酶高达3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力达139.27 U/g，为提高酱香型白酒品质研究奠定了基础。

酱香大曲；高产蛋白酶；发酵工艺；地衣芽胞杆菌

酱香型白酒具有独特的生产工艺，综合概括其特点为“四高三长，一大一多”，其中高温制曲就是“四高”之一，高温酱香型大曲是酱香的原动力及来源。酱香型大曲的制曲温度高达65℃，在高温低湿的环境下，形成了特殊的微生物体系，这些微生物的代谢产物对酱香型白酒的风格具有重要贡献［1-2］。

酱香型大曲的制曲过程中，在其特定的工艺条件下，微生物通过自身的生长代谢可产生丰富的酶系，其中就包含了对白酒生产至关重要的蛋白酶和淀粉酶，蛋白酶可将原料中的粗蛋白降解成各种氨基酸，使得大曲中富含的氨基酸种类和数量增多。同时，淀粉酶将原料中的淀粉降解成糖，氨基酸和糖在其特殊的环境中发生美拉德反应，生成具有酱香风味的物质。其次，氨基酸加热分解时也会产生酱香味物质［3］。大曲不仅为酿造提供了糖化发酵剂，还为发酵提供了前体物质［4］。

蛋白酶在白酒的酿造过程中，可以有溶解发酵原料的颗粒、促进微生物繁殖以及分解蛋白质生成香味物质、降解酵母菌体蛋白等多种功能，高活力的蛋白酶可以提高白酒的产量和质量［5］。本研究从酱香大曲中通过模拟酱香大曲发酵工艺，采用福林酚法测蛋白酶活力，分离筛选出高产蛋白酶的细菌，有助于酱香大曲中高产蛋白酶微生物的研究，对生产出优良的酱香大曲具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

酱香大曲：贵州珍酒酿酒有限公司提供；酪氨酸：上海长江生物制药厂；干酪素、无水碳酸钠、磷酸二氢钾：天津市海光化学试剂厂；福林-酚：北京索莱宝生物科技有限公司；三氯乙酸、冰乙酸、乙酸钠：重庆北碚精细化工厂；磷酸氢二钾：成都市科龙化工试剂厂。以上试剂均为分析纯。

分离培养基采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蛋白胨10 g，营养琼脂15～20 g加蒸馏水定容至1 000 mL，pH值为7.0～7.2，121℃灭菌20 min。

液体培养基：牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蛋白胨10 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，pH值为7.0～7.2，121℃灭菌20 min。

酪蛋白琼脂培养基：干酪素10.0 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，磷酸氢二钠2 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，pH值为7.0～7.2，121℃灭菌20 min。

固体培养基：麸皮20g，蒸馏水20mL，121℃灭菌20 min。

1.2仪器与设备

JJ-CJ-IFD超净工作台：苏州市金净净化设备科技有限公司；THZ-92B台式恒温振荡器：上海浦东物理光学仪器厂；YXQ-LS-75G立式压力蒸汽灭菌器、BMJ-250C微生物培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备；FA1004电子天平：上海箐海仪器有限公司；BM1000生物显微镜：河南兄弟仪器设备有限公司；GT10-1型离心机：北京时代北利离心机有限公司；PTC-100 PCR仪器：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1功能细菌的分离、纯化

在无菌条件下称取成品样品大曲10 g，加入已灭菌的生理盐水90 mL，混匀制备成菌悬液。再从中取菌悬液1mL加入无菌生理盐水，以10倍为稀释单位，逐次稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，从不同稀释倍数的菌悬液中取0.2 mL涂布接种于平皿上，其中10-4和10-7倍各做3个平行，10-5和10-6倍各做5个平行，35℃倒置培养1 d［6］。将平皿上长势良好且菌落形态上有较大差异的细菌采用平板划线法将其纯化，然后接入固体斜面培养基上，4℃保存备用。

1.3.2产蛋白酶细菌初筛

将以上分离得到的菌株做透明圈实验，以透明圈作为考察指标进行初筛。从固体斜面培养基上将细菌转接至牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上活化，然后将这些菌株以点接法接种到酪蛋白琼脂培养基上，35℃倒置培养1 d后观察透明圈大小，并用直尺测量透明圈直径D（mm）和菌落直径d（mm）的比值（D/d），选出能产生较大透明圈的菌株。

1.3.3产蛋白酶细菌复筛

模拟生产发酵工艺，将筛选出的能产生较大透明圈的菌株进行复筛，做菌种产蛋白酶性能试验。先将菌株接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，35℃倒置培养24 h后，然后从平板上的单菌落挑取一环移至液体培养基中，35℃摇床培养24 h制备成菌悬液。以10%的接种量将菌悬液加到固体培养基中。按照35℃、45℃、55℃24 h梯度升温静置培养3 d［7］。称取10 g固态发酵产物于250 mL三角瓶中，加入90 mL蒸馏水，40℃水浴锅中水浴1 h，其中每隔15 min搅拌一次，经滤纸过滤后获得粗酶液。分别配制pH 3.0的乙酸乙酸钠缓冲液和pH 7.2的磷酸缓冲液，测定其酸性和中性蛋白酶。

1.3.4蛋白酶活力测定

采用福林-酚法测蛋白酶活力，具体操作步骤参见商业行业标准SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》，绘制酪氨酸标准曲线。蛋白酶活力定义：在40℃条件下，每1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活性单位（U/g）。蛋白酶活力计算公式如下：

式中：A为由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数，μg；4为4 mL反应液取出1 mL测定；N为酶液稀释的倍数；10为反应时间，min；W为样品水分百分含量，%。

1.3.5高产蛋白酶菌株的鉴定

（1）菌株形态学观察

将高产蛋白酶的细菌在平板上活化，再以点接法接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，观察其单菌落形态。革兰氏染色显微镜观察其菌体形态。

（2）生理生化试验

按《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）［8］及《一般细菌常用鉴定方法》［9］对细菌进行生理生化试验。

（3）分子生物学鉴定

根据细菌DNA提取试剂盒说明书，采用细菌16S rDNA通用PCR引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行扩增［13］，在25.0 μL PCR反应体系中，加上、下游引物1492r和27f各1.0 μL，Mix 12.5 μL，细菌DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增条件为初始变性94℃、5 min，然后变性94℃、0.5 min，退火55℃、0.5 min，复性72℃、1.5 min，30个循环，最后延伸72℃、10 min。取2 μL DNA溶液于1%琼脂糖凝胶100 V电泳40 min左右。

测序由上海生物工程有限公司完成，采用16S rDNA测序方法对菌株进行分子鉴定。所得测序结果输入美国国家生物信息技术中心（National Center of Biotechnology Information NCBI）数据库中进行BLAST比对，用Neighbor-Joining构建目标菌的系统发育树。

2　结果与分析

2.1功能细菌的分离

通过平板稀释涂布法，从酱香大曲中分离得到18株菌落形态上有较大差异的细菌。

2.2功能细菌的筛选

2.2.1产蛋白酶细菌初筛

观察由点接法接种的酪蛋白琼脂培养基，不同菌种在培养基上出现了大小不一的透明圈，其中有7株透明圈较大，测得其HC值，结果如表1所示。

表1　透明圈HC值Table 1 HC value of the transparent circle

由表1可知，FBKL1.0199菌株透明圈与菌落直径比值最大，说明其对培养基中干酪素的分解利用能力较强，即产生蛋白酶的活力较高。对以上菌株进行复筛，以准确测定其所产蛋白酶活力。

2.2.2产蛋白酶细菌复筛

以吸光度值（y）为纵坐标，酪氨酸质量浓度（x）为横坐标，绘制酪氨酸标准曲线如图1所示。

图1　酪氨酸标准曲线Fig.1 Standard curve of tyrosine

由图1可知，酪氨酸标准曲线回归方程为y=0.009 2x+ 0.006 4，相关系数R为0.996 6，表明二者线性关系良好。

将初筛得到的7株细菌制备成菌悬液，以10%的接种量加入到固体培养基中，模拟大曲生产发酵工艺，培养3 d后取其发酵产物用福林-酚法测定其中性和酸性蛋白酶。其结果分别如表2和表3所示。

由表2和表3可以看出，产中性蛋白酶最高的是FBKL 1.0199，其蛋白酶活力高达3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力也相对较高，达139.27 U/g。产酸性蛋白酶最高的是FBKL 1.0191，蛋白酶活力为189.07 U/g，但其中性蛋白酶酶活较低，仅为90.94 U/g。综合以上结果，FBKL 1.0199菌株具有高产蛋白酶的特性，选择FBKL 1.0199进行种属鉴定。

表2　中性蛋白酶活力测定结果Table 2 Determination results of neutral protease activities

表3　酸性蛋白活力测定结果Table 3 Determination results of acid protease activities

2.2.3高产蛋白酶菌株鉴定

（1）菌株形态学观察

对筛选出的FBKL1.0199以点接法接种进行培养，观察其菌落形态及细胞形态，结果如图2所示。由图2可知，FBKL1.0199菌株菌落颜色为灰白色，中间有微黄小环，菌落呈圆形，微微凸起，边缘为鞭毛状，干燥无光泽。革兰氏染色菌体呈紫色，为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状。

图2　FBKL1.0199的菌落形态（A）和细胞形态（B）Fig.2 Colony morphology（A）and cell morphology（B）of strain FBKL1.0199

（2）生理生化试验

高产蛋白酶菌株FBKL1.0199生理生化试验结果见表4。

由表4可知，FBKL1.0199菌株其生理生化实验结果表明，其接触酶呈阳性，能利用葡萄糖、麦芽糖、甘露糖产酸，可利用柠檬酸盐，兼性厌氧。参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步认定FBKL1.0199菌株为芽孢杆菌属（Bacillussp.），利用分子生物学手段对其进行进一步的鉴定。

表4　FBKL1.0199生理生化试验结果Table 4 Physiological and biochemical tests results of strain FBKL1.0199

（3）分子生物学鉴定

采用16S rDNA测序方法对FBKL1.0199菌株进行分子鉴定，对DNA进行序列扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。由图3可知，PCR扩增片段长度约为1 500 bp左右。将所得测序结果输入NCBI中进行BLAST比对，用Neighbor-Joining法构建目标菌的系统发育树，结果见图4，根据比对结果FBKL1.0199与地衣芽孢杆菌相似性达到99%，结合菌落形态及生理生化实验，将其鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

图3　FBKL1.0199PCR扩增产物电泳图谱Fig.3 Electrophoresis pattern of PCR amplification products of strain FBKL1.0199

图4　FBKL1.0199系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain FBKL1.0199

3　结论

采用平板稀释涂布法分离纯化，筛选获得了一株高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌FBKL1.0199，模拟酱香型大曲生产发酵工艺，通过梯度升温发酵，其所产的中性蛋白酶活力高达3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力达139.27 U/g。同时，其固态发酵产物具有明显的酱香气味，这说明了其对于酱香型酒风格的形成具有重大作用。

综上所述，筛选得到的地衣芽孢杆菌FBKL1.0199对酱香型白酒的生产有重要意义，进一步研究FBKL1.0199固态发酵时的代谢情况，探究其代谢产物与酱香风味成分的关系，为生产提供了理论基础依据。

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Screening and identification of functional bacteria with high-yield protease from Moutai-flavor Daqu

WANG Jing1，2，WANG Xiaodan1，2，3，LUO Xiaoye1，2，QIU Shuyi1，2，XIAO Bei1，2，ZHANG Xiaolong1，3，HU Penggang1，2*
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；3.School of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Through separation and purification of bacteria from Moutai-flavor Daqu，strain FBKL1.0199 with high-yield protease was acquired，and after morphology observation，physiological and biochemical experiment，and molecular biology identification，the strain was identified asBacillus licheniformis.Under the experimental conditions，the neutral protease was as high as 3 925.80 U/g，and the acid protease activity reached 139.27 U/g，which laid a foundation for improving the quality of Moutai-flavor liquor.

Moutai-flavor Daqu；high-yield protease；fermentation process；Bacillus licheniformis

TS261.1

A

0254-5071（2015）10-0043-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.010

2015-09-16

贵州省科技厅重点攻关项目（黔科合GZ字［2014］3012）；贵州省科技厅重大专项项目（黔科合重大专项字［2013］6009号）；科技部科技支撑计划项目课题（2011BAC06B12）；贵州省科技厅联合资金项目（黔科合LH字［2014］7672）

王婧（1991-），女，硕士研究生，研究方向为发酵工程。

胡鹏刚（1964-），男，教授，本科，研究方向为发酵工程和现代分离技术。