大豆花荚脱落及单株荚数的QTL定位

徐 琐，孙晓环，孙 霞，王燕平，宗春美，齐玉鑫，白艳凤，任海洋，潘相文，杜维广，孔凡江，刘宝辉

(1.中国科学院大豆分子设计育种重点实验室，中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑龙江哈尔滨150081; 2.中国科学院大学，北京100049;3.黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江牡丹江157041)

大豆花荚脱落及单株荚数的QTL定位

徐 琐1，2，孙晓环3，孙 霞1，王燕平3，宗春美3，齐玉鑫3，白艳凤3，任海洋3，潘相文1，杜维广3，孔凡江1，刘宝辉1

(1.中国科学院大豆分子设计育种重点实验室，中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑龙江哈尔滨150081; 2.中国科学院大学，北京100049;3.黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江牡丹江157041)

大豆花荚脱落率和单株荚数是影响大豆单株产量的两个主要性状。研究以花荚脱落率高的大豆品种吉育73为母本及花荚脱落率低的铁荚四粒黄为父本，构建了样本容量为100的F2遗传群体。所构筑的遗传图谱总长为1 351.5 cM，具34个连锁群。利用多QTL模型(MQM)对该群体花荚脱落率和单株荚数进行QTL定位，共鉴定出2个花荚脱落率QTL，同位于GM16染色体上，遗传贡献率分别为10.9%和9.7%;同时鉴定出5个控制单株荚数的QTL，分别位于GM02、GM07、GM10、GM04和GM05染色体上，遗传贡献率介于8.8%～15.9%之间。研究结果为大豆花荚脱落性状QTL的精细定位、候选基因克隆和分子标记辅助育种提供了理论基础和育种材料。图1，表3，参34。

大豆;花荚脱落率;单株荚数;QTL

0 引 言

植物器官脱落(organ abscission)是植物以一种可控方式将其某一器官与母体分离的过程，通常发生在植物一个特定的区域-离区(abscission zone)［1］。花和果实脱落会严重导致农作物产量下降，有关植物器官脱落的研究已在其分子机制方面逐步深入，研究表明植物器官脱落是一个包括离区分化、脱落信号激活、细胞分离等诸多步骤的复杂过程。相关研究在拟南芥、水稻、番茄中较为成熟［2］，已经克隆到BOP1/BOP2［3］、SH4［4］、qSH1［5］、SHAT1［6］、MADS-box［7］等多个控制离区分化的基因。在拟南芥中，离区形成后，MAPK联级通路被激活能抑制KNAT1从而调节脱落发生［8］;在对拟南芥因荚果开裂导致的落粒性研究中，已初步明确了调控荚果离层发育的网络［9］。在其它作物中，对器官脱落的分子机制的相关研究也逐步展开，例如在小麦种子落粒的研究中，对小麦驯化过程其重要作用的Q基因调控离区分化，并且与水稻SHAT1同源［10］。

大豆作为重要的油料作物，花、荚器官的脱落严重影响了大豆产量，因此揭示其分子机理对大豆高产分子育种具有重要的意义。研究者对影响大豆花荚脱落的环境因素［11］、生理生化和激素水平［12-14］进行了大量研究，但直接调控大豆花荚脱落的分子机理尚不清楚。近代以来，利用分子生物学的技术手段研究复杂的数量性状有了跨越式的发展，大量的功能基因通过QTL定位的方法被找到。在大豆花荚QTL定位方面，已有大量与花数和荚数相对的研究报道［15-24］，但与花荚脱落相关的QTL定位则较少。2014年王欢等［25］以东北春大豆组成的自然群体为材料，进行花荚脱落性状与SSR标记的关联分析，初步鉴定出有4个与大豆花荚脱落率显著相关的位点。

研究选择花荚脱落率差异显著的大豆品种吉育73和铁荚四粒黄为亲本，配制F2遗传群体，通过对群体的单株及亲本的花荚脱落性状进行表型鉴定，以SSR分子标记为基础构建遗传图谱，分析获得大豆花荚脱落性状的QTL。本研究是从分子水平初步定位与大豆花荚脱落性状相关的QTL位点，为后续构建永久群体进行精细定位奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

根据实验室2012年自然群体花荚脱落田间实验结果［25］，选用大豆花荚脱落率高的吉育73为母本，花荚脱落率低的铁荚四粒黄为父本，配制杂交组合，获得F2代群体 (100个单株)作为实验材料。2014年将F2代群体和两个亲本材料种植于黑龙江省农业科学院牡丹江分院大豆实验田，种植行长2 m，行距65 cm，株距25 cm，采取常规田间管理。

1.2 性状调查与分析

根据Fehr等［26］提出的大豆生育时期的鉴定方法确定大豆生育时期。参照王欢［25］的实验方法，在始花期 (R1期)，对每个单株套网箱;在始荚期 (R3)、成熟期 (R8期)调查纱布网内花和荚的脱落数;成熟后对每个单株分别考种，记录单株荚数。计算公式为:花荚脱落率 (%)=［单株花荚脱落总数/(单株花荚脱落总数+单株荚数)］ ×100%。利用SPSS 20.0软件分别统计花荚脱落率的平均值、标准差等。

1.3 标记分析

分别取植株顶端第二节嫩叶，CTAB法［27］提取总DNA。结合Song等［28］构建的公共图谱和大豆数据库Soybase(http://soybean.org/)提供的大豆SSR序列，合成1015对SSR引物;根据基因组重测序结果，利用生物信息学预测了启动子特异性标记 (PSI)，合成了207对PSI引物，用于筛选。PCR反应体系:包括50 ng DNA、0.5μl引物对(10 ng·L-1)、5μl 2×Takara PCR mastermix，加dH2O至10μl。SSR引物的反应程序为94℃5 min;94℃30sec，46℃30sec，72℃30sec，40个循环;72℃5 min。PSI引物的反应程序为94℃5min;94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，35个循环;72℃5min。聚丙烯氨酰胺凝胶分离PCR扩增产物，在成像系统中扫描。

1.4 连锁作图和QTL分析

运用Map Manager QTXb20软件的Kosambi函数和P值为0.001构建分子标记连锁图谱，用Mapchart 2.1绘制连锁图谱。根据苏成付等［29］的研究，选择较为稳定的、假阳性比率低的 QTL分析方法，即MapQTL 5.0(Van Ooijen 2004)［30］软件多QTL模型(MQM)。以排列测验法(permutation test)［31］确定每个性状LOD值的阈值，如果临近位点间图距小于5 cM，初步认定是同一个QTL。采用McCouch等［32］的方法命名定位到的QTL。

2 结果与分析

2.1 大豆花荚脱落相关性状在F2群体中的表现

对F2群体的100个单株花荚脱落率和单株荚数进行统计分析的结果表明，花荚脱落率幅度为8.0%～4 9.0%，平均花荚脱落率为29.0%，标准差8.07，见表1。单株荚数幅度为每株27个～222个，平均122.2个，标准差为36.89。两个性状在F2群体中最小值和最大值之间差异明显，标准差大，变异幅度较大，均呈连续的正态分布且具有广泛的分布频率，满足QTL分析要求。

表1 F2群体中花荚脱落率与单株荚数的描述性统计Tab.1 Descriptive statistics for flower and pod abscission rate and pods number per plant in F2 population

2.2 连锁图谱的构建

以合成的1015对SSR引物和207对PSI引物进行扩增，其中138个SSR标记和13个PSI标记具有多态性，见表2。利用作图软件Map Manager QTXb20绘制连锁图谱，得到一张包括34个连锁群的分子遗传图谱，共151个标记，覆盖大豆基因组长度为1 351.5 cM，标记间平均距离为11.55 cM。与公共图谱进行比较，结果表明34个连锁群都可以与公共图谱中的染色体对应上，1、2、8、10、11、13、14、15、16、17、18、20号染色体分为2个连锁群，4号染色体分为3个连锁群，见图1。

表2 PSI标记信息Tab.2 Marker information for PSI

2.3 大豆花荚脱落相关性状的QTL定位

采用多QTL模型对大豆花荚脱落率及其相关性状进行QTL分析，结果表明花荚脱落率和单株荚数这两个性状共定位到7个QTL，见图1、表3。

检测到控制大豆花荚脱落率的2个QTL都定位于LG26(GM16)连锁群。qFPAR26-1位于GMES6898-SJ030区间，与GMES6898距离为4.0 cM，遗传贡献率为10.9%;qFPAR26-2定位于标记Satt456，遗传贡献率为9.7%。两个QTL的加性效应为正，表明增效基因均来自母本吉育73。检测到了5个单株荚数QTL，分别位于LG4(GM2)、LG7(GM4)、LG9(GM5)、LG11(GM7)、LG15(GM10)连锁群上，遗传贡献率在8.8%～15.9%之间。所定位到的这5个QTL的加性效应也都为正值，即加性效应都是来自于吉育73的贡献。

表3 F2群体中花荚脱落率与单株荚数QTL检测结果Tab.3 QTL analysis of flower and pod abscission rate and pods number per plant in F2 population

3 讨 论

大豆花荚脱落是影响大豆产量的一个重要因素，长期以来对如何降低大豆花荚脱落率进行了大量的研究，而对其QTL定位的研究还较少。研究运用MQM方法对大豆F2群体的花荚脱落率进行分析，检测到2个与其相关的QTL，都位于LG26(GM16)连锁群上。王欢等［25］采用关联分析的方法对大豆自然群体的花荚脱落性状进行了分析，发现在16号染色体上与大豆花荚脱落率显著相关的位点Satt244。在LG26 (GM16)上定位到的qFPAR26-2距该位点25 cM，qFPAR26-1距该位点35 cM。将QTL分析结果与大豆数据库Soybase已有的相应QTL进行了对比分析，LG26(GM16)上的这两个QTL与大豆单株荚数的QTL(qpn-Chr16)［19］位置重叠，与调控大豆荚开裂性状的基因SHAT1-5［33-34］相距10 cM～20 cM。已有研究表明相关性状QTL位点聚集分布可能是由于控制相关性状的基因紧密排列所致，即相关性状的QTL有集中分布的现象［21］。实验中将花荚脱落率QTL定位在16号染色体上，并且附近有已定位到的调控相关性状的QTL和基因，可能是调控大豆花荚脱落较为可靠的QTL。此结果是获得大豆花荚脱落相关QTL精细定位的基础实验，为后续实验提供参考。与公共图谱相比，研究所构建的遗传图谱还存在不少未覆盖到部分，王欢等［25］关联到与大豆花荚脱落率显著相关的位点Satt244，不在已构建的遗传图谱范围内，这也可能是导致本研究定位到的相关QTL位点较少的原因。因此进一步研究需要开发新的标记，完善该图谱。

大豆单株荚数是一个与产量相关的农艺性状，在多个染色体上都已检测到了相应的QTL。研究在LG4 (GM02)上定位到的qPNPP4-1与向仕华等［16］检测到的单株荚数QTL(Satt644-Sat_069)位置重叠，可能属于同一个QTL位点;在LG7(GM04)上定位到qPNPP7-1与王智贤等［17］检测到的1个位于4号染色体上的QTL(Satt661～EA1MC11-2)位置重合。另外陈庆山等［18］将单株荚数QTL定位在6和10号染色体上;Zhang等［19］在5、8、16号等染色体上检测到单株荚数QTL。这些检测到的单株荚数QTL有些与前人研究一致，表明该位点可在不同群体、环境条件下重复检测到，是较为可靠的QTL位点。在实验中也同样在LG9(GM05)、LG15(GM10)上定位到QTL，但距离较远。LG11(GM07)连锁群上定位到的qPNPP11-1与前人研究结果不同，但在相同位置有一个与大豆每节荚数性状相关的QTL［19］，考虑到相关性状QTL存在共位性的特点，也极有可能是新的与单株荚数相关的位点。

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QTL M apping of Flower and Pod Abscission and Pod Number per Plant in Soybean

XU Yan1，2，SUN Xiao-huan3，SUN Xia1，WANG Yan-ping3，ZONG Chun-mei3，QIYu-xin3，BAIYan-feng3，REN Hai-yang3，PAN Xiang-wen1，DUWei-guang3，KONG Fan-jiang1，LIU Bao-hui1
(1.Key Laboratory of Soybean Molecular Design Breeding，Northeast Institute of Geography and Agroecology，CAS，Harbin 150081，China;2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China; 3.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Mudanjiang Branch，Mudanjiang 157041，China)

Flower and pod abscission rate and pod number per plantare two key factors that influence plant yield in soybean.A F2 population of100 plants derived from a cross between cultivar Jiyu 73 and Tiejiasilihuang，both of which have contrasting flower and pod abscission rates.A genetic linkagemap of soybean was constructed，that consisting 34 linkage groups covering 1351.5 cM.Themultiple-QTLmodels(MQM)was used to identify quantitative trait loci(QTL)associated with flower and pod abscission rate and pod number per plant.Two QTLswere identified for flower and pod abscission rate on the same chromosome 16(GM16)and their genetic contribution rates were 10.9%and 9.7%，respectively.Five QTLs for pods number per plant were detected on chromosome GM02，GM07，GM10，GM04 and GM05，respectively.The genetic contribution rateswere from 8.8%to15.9%.The results obtained in this study will be useful for further finemapping，gene cloning and marker assisted selection of these traits.

soybean;flower and pod abscission rate;pod number per plant;QTL

10.11689/j.issn.2095-2961.2015.02.004

2095-2961(2015)02-0071-06

Q37;S529

A

2015-02-03;

2015-03-09.

黑龙江省自然科学基金重点项目 (ZD201409).

共同第一作者简介:徐琰 (1988-)，女，黑龙江哈尔滨人，在读硕士，主要从事大豆分子育种研究;

孙晓环 (1983-)，女，吉林通化人，助理研究员，主要从事大豆遗传育种研究.

刘宝辉 (1964-)，男，黑龙江绥化人，研究员，博士生导师，主要从事大豆分子设计育种研究.

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