枯草芽孢杆菌SB--24对尖孢镰刀菌拮抗机理

谢丽华，高 虹，陈明丽，冯 涛

(黑龙江省农垦科学院植物保护研究所，黑龙江哈尔滨150038)

枯草芽孢杆菌SB
--24对尖孢镰刀菌拮抗机理

谢丽华，高 虹，陈明丽，冯 涛

(黑龙江省农垦科学院植物保护研究所，黑龙江哈尔滨150038)

通过SB-24菌株对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制、菌丝形态的影响及对孢子萌发的抑制，SB-24分泌水解酶能力的研究，探索SB-24对尖孢镰刀菌的抑制机理。结果表明:SB-24对尖孢镰刀菌菌丝的抑制作用是通过菌体及其产生的拮抗物质，分泌水解酶 (蛋白酶和纤维素酶)共同作用的结果;SB-24对尖孢镰刀菌孢子的抑制作用主要是其产生拮抗物质作用的结果。图4，表2，参6。

枯草芽孢杆菌;尖孢镰刀菌;拮抗机理

0 引 言

大豆根腐病是一种分布广、危害重［1］、病原菌种类繁多［1-5］和防治困难的世界性病害，仅黑龙江垦区的发病率即达75%～90%，常年减产10%～30%，重病地可减产60%，甚至绝收［6］，目前生产上主要采用35%多克福种衣剂防治，种子包衣虽然在大豆根腐病的防治中起到重要作用，但是它不仅抑制大豆结瘤、氮的固定和破坏微生物环境，而且近年来东北地区早春多低温高湿，种衣剂药害发生普遍，影响幼苗生长。随着生活水平提高，环保意识增强，利用有益微生物拮抗病原菌进行生物防治逐渐得到了重视。

SB-24菌株从加拿大农业及农产食品部，加东禾谷类和油料作物研究中心引进，属广谱抗性生防菌株，经中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心鉴定确定其为枯草芽孢菌。探索SB-24对尖孢镰刀菌拮抗机理，为提高生防菌剂的稳定性提供基础性研究资料。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SB-24由加拿大农业及农产食品部，加东禾谷类和油料作物研究中心引进;大豆根腐病病原菌尖孢镰刀(Fusarium oxysporum)由八一农垦大学提供。

1.2 培养基

LB培养基:胰蛋白胨10 g，酵母提取物5g，氯化钠10 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 000 ml。

PDA培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 000 ml。

羧甲基纤维素培养基(CMC):CMC-Na 5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，(NH4)2SO40.5 g，K2HPO40.25 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 000 ml。

酪素培养基:牛肉膏0.3 g，NaCl 0.5 g，酪素1 g，琼脂粉17 g，pH 7.6～8，蒸馏水1 000 ml。

1.3 粗提物、无细胞滤液对尖抱镰刀菌的抑制作用及对菌丝形态的影响研究

1.3.1 拮抗菌粗提物、无细胞滤液的制备。将SB-24菌株接种于100mL LB培养基中，振荡培养(32℃，150 r·min-1)48 h进行发酵，4℃离心发酵液 (8 000 r·min-1，10 min)获得粗提物，粗提物经微孔滤膜 (0.22μm，Φ25 mm)过滤除菌后获得无细胞滤液用于抑菌活性测定。

1.3.2 粗提物、无细胞滤液对尖孢镰刀菌的抑制作用。把SB-24菌株的粗提物、无细胞滤液分别按0.2∶100、0.5∶100、1∶100的比例加到约45℃的PDA培养基中，轻摇混匀，倒平板，待冷凝后接种尖孢镰刀菌菌饼 (Φ6 mm)，28℃下倒置培养3 d～5 d。每皿重复3次，取平均值。以空白PDA平板上生长的病菌作为空白对照。

1.3.3 粗提物、无细胞滤液对禾谷镰刀菌菌丝形态的影响。挑取1.3.2处理菌落边缘菌丝镜检，观察拮抗细菌对菌丝生长的影响，以PDA培养基正常培养的菌丝为对照。

1.4 粗提物、无细胞滤液对抱子萌发及其形态的影响研究

尖孢镰刀菌孢子的制备。用100 ml无菌水冲下预先在麦粒培养基上培养好的病原菌孢子，用4层无菌的纱布过滤，在离心机上离心5 min(1 000 r·min-1)，去除上清液，加入无菌水进行2次离心，用无菌水重悬浮，稀释10-1，在血球计数板上计数，然后与等量0.5%葡萄糖溶液混合，制成孢子悬浮液，孢子数2×105～2.2×105。

孢子萌发试验。取无菌凹玻片，加入20 ul孢子悬浮液，然后分别加入0.2∶100、0.5∶100、1∶100的SB-24粗提物、无细胞滤液，上加无菌盖玻片封口，将凹玻片放于经灭菌的、含湿滤纸的培养皿中25℃下保湿培养24h，记录孢子萌发数量。以无菌水做对照。每处理4次重复。

孢子萌发率%=孢子萌发数/总孢子数*100

孢子萌发抑制率%=(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率*100

1.5 SB-24产纤维素酶、产蛋白酶能力检测

SB-24产纤维素酶能力测定。将活化的SB-24点接在CMC培养基上，每皿点接3点。30℃培养2 d，将1 mg·ml-1的刚果红溶液5 ml滴入培养基上，15 min后倒去溶液，加入1 mol·L-1的NaCl溶液5 m l，15 min后倒去，观察菌落周围培养基的变化情况。

SB-24产蛋白酶能力测定。将活化的SB-24点接在酪蛋白培养基上，每皿点接3个点。30℃培养2 d，观察菌落周围培养基变化。

2 结果与分析

2.1 SB-24粗提物，无细胞滤液对尖抱镰刀菌的抑制效果

SB-24粗提物，无细胞滤液对尖孢镰刀菌均有抑制作用，抑制率达74.3%～80.4%，见表1，图1。1%、0.5%的浓度对尖孢镰刀菌的抑制好于0.2%的浓度;同等浓度下粗提物的作用强于 (除SB-24 1%)无细胞物，差异不显著，说明SB-24对尖孢镰刀菌的抑制作用是菌体及其产生的拮抗物质共同作用的结果。

表1 SB-24粗提物，无细胞滤液对尖抱镰刀菌的抑制效果Tab.1 The inhibition effect of crude substance and no cell filtrate of SB-24 against the growth of Fusarium oxysporum

图1 SB-24粗提物，无细胞滤液对尖抱镰刀菌的抑制效果Fig.1 The inhibition effect of crude substance and no cell filtrate of SB-24 against the growth of Fusarium oxysporum

2.2 SB-24粗提物，无细胞滤液对尖抱镰刀菌菌丝形态影响

SB-24粗提物，无细胞滤液对尖孢镰刀菌菌丝具有明显的致畸作用，见图2。正常菌丝边缘细、直、分叉稀少、菌丝光滑，而有拮抗菌SB-24存在时菌丝严重交联，节间变短、扭曲，分叉增多，形成树状集结，颜色加深。

2.3 SB-24粗提物，无细胞滤液对尖抱镰刀菌抱子萌发的影响

SB-24对尖孢镰刀菌孢子萌发均有一定的抑制作用，1%SB-24无细胞物对尖孢镰刀菌孢子萌发抑制率最高，为73.4%，见表2。总体来说，无细胞物对孢子萌发的抑制作用强于粗提物，说明主要是拮抗菌的代谢物抑制病原菌孢子萌发。

2.4 SB-24产纤维素酶和蛋白酶能力测定

SB-24在羧甲基纤维素培养基上生长2天后，用刚果红染色后，菌落周围出现浅红色水解圈，菌株在生长代谢过程中可以产生纤维素酶，分解培养基中的羧甲基纤维素钠，见图3。

SB-24在酪蛋白培养基上生长2天后，菌落周围出现透明水解圈，表明在生长代谢过程中产生蛋白酶，分解了培养基中的酪蛋白，见图4。

图2 B-24粗提物，无细胞滤液对尖抱镰刀菌菌丝形态的影响 (×10)Fig.2 The effect of crude substance and no cell filtrate of SB-24 on Fusarium oxysporum mycelium form

表2 SB-24对尖抱镰刀菌抱子萌发的抑制作用Tab.2 The inhibition effect of SB-24 against the spore germination of Fusarium oxysporum

图3 纤维素培养基上的菌落形态Fig.3 Colonymorphology of SB-24 on cellulose decomposingmicroorganismsmedium

图4 酪蛋白培养基上的菌落形态Fig.4 Colonymorphology of SB-24 on casaminomedium

3 结 论

SB-24对尖孢镰刀菌菌丝的抑制作用是菌体及其产生的拮抗物质共同作用的结果，对尖孢镰刀菌菌丝的抑制率达70%以上，菌丝明显畸形，严重交联，节间变短、扭曲，分叉增多，形成树状集结，颜色加深。SB-24可以分泌水解酶 (蛋白酶和纤维素酶)，对尖孢镰刀菌细胞壁有一定的分解作用。

SB-24抑制尖孢镰刀菌孢子萌发主要是其拮抗菌的代谢物起作用，1%无细胞物对孢子萌发抑制作用强，萌发抑制率达73.4%。

［1］ 马汇泉，辛惠普.大豆根腐病病原菌种类鉴定及其生物学研究 ［J］.黑龙江八一农垦大学学报，1988(2):115-121.

［2］ 高同春，周书其，王振荣，等.大豆根腐病病原物的分离、鉴定及致病性测定 ［J］.安微农业科学，1992，20(1):79-81.

［3］ 马桂珍，暴增海，杨文兰.冀东地区大豆根腐病病原菌的鉴定 ［J］.河北农业技术师范学院，1994，8(4):70-72.

［4］ 李宝英，马淑梅.大豆根腐病病原菌种类及抗原筛选 ［J］.植物保护学报，2000，27(1):91-92.

［5］ 韩庆新，辛惠普.大豆根腐病主要病原菌对大豆幼苗致病性的初步研究 ［J］.大豆科学，1990，9(2):157-162.

［6］ 张玉华.黑龙江省大豆根腐病的危害与防治 ［J］.大豆通报，1996(1):29.

Antagonistic M echanism of Bacillus subtilis Strain SB-24 on Fusarium oxysporum

XIE Li-hua，GAO Hong，CHEN Ming-li，FENG Tao
(Institute of Plant Protection，Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences，Harbin 150038，China)

In this study，the inhibition of strain SB-24 on the growth of Fusarium oxysporum mycelium and spore，mycelium form of Fusarium oxysporum and its capability of secreting hydrolytic enzymes were examined.The results showed that strain SB-24 inhibited the growth of Fusarium oxysporum mycelium，which wasmostly due to the integration of production of antibioticmaterial and hydrolytic enzymes including proteineous enzyme and cellulase.Antagonistic effectof strain SB-24 on Fusarium oxysporum spores is in nature the production of antibiotic material.

Bacillus subtilis;Fusarium oxysporum;antagonistic mechanism

10.11689/j.issn.2095-2961.2015.02.007

2095-2961(2015)02-0091-05

S476+.19

A

2015-01-16;

2015-04-15.

黑龙江省科技厅对外科技合作资助项目 (WB10B103).

谢丽华 (1980-)，女，黑龙江哈尔滨人，硕士，助理研究员，研究方向为生物防治.

高虹 (1964-)，女，黑龙江哈尔滨人，学士，研究员，研究方向为生物防治.