石化工业污水中分离筛选苯酚降解菌及其降解率研究
2015-09-30丁海燕张国发武燕冯伟
丁海燕+张国发+武燕+冯伟
摘 要：自然界中某些微生物具有较强的酚降解能力，利用微生物处理含酚废水的方法受到了越来越广泛的重视。该文通过梯度平板法从石化工业废水中分离筛选得到3株降解酚的细菌，苯酚降解率分别为90.9%、82.5%、74.9%。对其进一步深入研究，进而将其应用到工厂等污水处理方面，降低含苯酚的废水排出，具有一定的指导意义。
关键词：石化工业污水；苯酚降解菌；降解率
中图分类号 X505 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）17-33-03
Isolation and Screening of Phenol Degrading Bacteria and its Degradation Rate in Petrochemical Industry Wastewater
Ding Haiyan et al.
（Daqing Normal University，Daqing 163712，China）
Abstract：Some microorganisms in nature have a strong ability to degrade phenol. The method of treating phenol wastewater by microorganism has been paid more and more attention. In this article，three strains of bacteria were isolated and screened from the petrochemical industrial wastewater by gradient plate method.The degradation rate of phenol was 90.9%，82.5% and 74.9%. It has guiding significance for further study，and then appling to the plant and other wastewater treatment，reducing the wastewater containing phenol wastewater discharge.
Key words：Petrochemical industrial wastewater；Phenol-degrading bacteria；degradation rate
含酚废水主要来自各类化工厂以及合成有机农药、染料等生产过程中，未经及时处理或分解，直接排放到河流中，造成了水源污染。酚是一种有毒物质，能与蛋白质发生化学反应，浓度小时可使细胞变性，浓度大时可使蛋白质凝结，酚类化合物都具有气味，有酸性，在空气中容易被氧化。含酚废水对环境的危害极大，造成了严重的水污染，在许多工业领域的废水中均含有苯酚。目前常用的苯酚的清除方法有如下2种，物理化学药剂的费用高，易造成再次污染；微生物处理含酚废水的方法费用少、效果好。研究表明，自然界中某些微生物具有很强的降解苯酚能力，微生物法处理苯酚方法越来越被广泛应用。近年来，从被酚类物质污染的环境中分离到了多种降酚微生物菌株，如假丝酵母（Candida Albicans）[1]、假单胞菌（Pseudomonadaceae）[2]、醋酸钙不动杆菌（A.calcoaceticus）[3]、根瘤菌（Rhizobium）[4]、藻类[5]、真养产碱菌（Alcaligeneseutrophus）[6]等。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌源 从大庆某化工厂取出的含酚废水，装入无菌的玻璃瓶中，拿回实验室进行菌种的分离。
1.1.2 实验所用培养基及试剂 （1）耐酚细菌培养基：牛肉膏6g/L，蛋白胨12g/L，氯化钠5g/L，琼脂16g/L，pH为7左右，121℃灭菌20min。（2）苯酚无机培养液：MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO40.3g/L，pH7.0～7.2，苯酚25mg，蒸馏水100mL，分装三角瓶，每瓶30mL，121℃灭菌20min。（3）碳源对照培养液A：葡萄糖25～75mg，尿素0.1g，微量元素10mL，蒸馏水90mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。（4）微量元素溶液：MgSO4.7H2O 0.3g/L，KH2PO4 0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.005g/L，CaCl2 0.005g/L。（5）苯酚培养液B：苯酚25～75mg，尿素0.1g，微量元素10mL，蒸馏水90mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。（6）无菌生理盐水：浓度为9%的盐水，121℃灭菌20min。
1.2 方法
1.2.1 梯度平板法分离 （1）梯度平板的制备：量取12mL不含苯酚的无菌耐酚培养基倒入直径为9mL的培养皿中，然后立刻将此培养皿斜着放置，让培养基固定成斜面状，并让培养基覆盖平板底部，凝固后放平，再加入12mL无菌的含苯酚耐酚细菌培养基，正好凝固成平面。（2）样品液稀释：将采集的含酚废水样品作10倍系列稀释。（3）涂布平板：用1mL移液管分别吸上述10-3、10-2、10-1和原液4种样品液0.1mL，滴在上述相应的梯度平板上，用涂布棒涂布菌液，使菌液分散开来，每种浓度作3个重复。（4）培养：将上述涂布了样品液的平板倒置于30°恒温箱中培养1～2d。（5）涂布法分离结果观察：从30℃恒温箱中取出分离平板，观察平板上耐酚细菌的生长状况。（6）耐酚细菌纯化：用无菌接种环挑取苯酚高浓度一侧单菌落的菌苔在含苯酚的耐酚细菌平板上三区划线纯化，培养后挑取单菌落接种到耐酚细菌斜面上，30℃培养3d。
1.2.2 耐酚细菌分离纯化及驯化 将采集的含酚废水加入含30mL苯酚无机培养液的三角瓶中，30℃培养3～5d，再添加3次苯酚无机培养液，从中选出在苯酚中能存活下来的菌株，对其进行驯化。
1.2.3 生长曲线测定 （1）标记：取5支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即：0、12、24、36h和48h。（2）接种：分别用5mL无菌吸管吸取2.5mL过夜培养液（培养10～12h）转入盛有30mL碳源对照液A和苯酚培养液B的三角烧瓶中，混合均匀后分别取5mL混合液放入上述标记的5支无菌大试管中。（3）培养：将已接种的试管置摇床30℃振荡培养48h（振荡频率4 000r/min），分别培养0、12、24、36和48h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊，测定其光密度值。（4）比浊测定：用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从中取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1～0.65（测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布）。
1.2.4 性能测定 （1）初筛。含不同苯酚B平板制备：按常规方法制备，苯酚终浓度分别为25mg/100mL、45mg/100mL、60mg/100mL、75mg/100mL。将分离纯化的耐酚能力强的菌株分别划线接种于上述制备的平板上，30℃培养1～2d。（2）复筛。用无菌接种环挑取一环经初筛获得的菌种菌苔转接于含30mL不含苯酚的耐酚细菌培养液的三角烧瓶中，30℃振荡培养1d后，将培养液离心5min，留沉淀，用生理盐水离心冲洗1次，最后用无菌生理盐水制备一定浓度的菌悬液。
1.2.5 苯酚降解率测定 以高浓度苯酚培养液中生长速度下降不明显者为出发菌株，接入含苯酚培养液B的三角烧瓶中，振荡培养48h，并分别于0h和48h测定发酵液苯酚浓度，计算苯酚降解率。计算公式如下：
苯酚降解率（%）=（未酵前发酵液苯酚含量-发酵终止时发酵液苯酚含量）/未发酵前发酵液苯酚含量×100
1.2.6 发酵液中苯酚含量的测定 发酵液中苯酚具有在NH4OH-NH4Cl缓冲液中游离出来的特点。当游离出来的苯酚与4-氨基安替比林混合时，两者可发生缩合反应。在氧化剂铁氰化钾作用下，酚被氧化成醌，并于4-氨基安替比林偶合而显色。将适量发酵液加入到50mL容量瓶中，同时分别吸取酚标准液0、0.5、1、2、3、4和5mL于各容量瓶中，用蒸馏水稀释至50mL，然后向酚标准溶液和发酵的稀释溶液中各加入0.25mL20%氨性氯化铵缓冲液、0.5mL2%4-氨基安替比林溶液和0.5mL8%铁氰化钾溶液，每次加入试剂后需混匀，放置15min后在A510处比色测定苯酚标准曲线，从曲线图中可查出发酵液中苯酚含量。
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选及驯化结果 共筛选出3株对苯酚具有降解能力的菌落，分别编号为W1、W2、W3。3个菌株的菌落的形状、透明度、颜色、边缘、高度等形态特征，如表1所示。
表1 菌落的形态特征
[菌株＼&形状＼&透明度＼&颜色＼&边缘＼&高度＼&W1
W2
W3＼&不规则圆
不规则圆
圆形＼&周围透明
不透明
不透明＼&中间褐色
乳白
金黄色＼&不整齐
不整齐
整齐＼&矮
较高
较高＼&]
2.2 苯酚降解细菌生长情况及苯酚降解率分析 将菌悬液接入含30mL苯酚培养液B的三角烧瓶中（接种量为50mg湿菌体/100mL培养液），30℃振荡培养48h。期间分别于发酵的0h、12h、24h、36h、48h取样测定光密度值，并绘制出生长曲线，见图1，在25mg/100mL苯酚培养液中生长速度下降不明显者为耐酚菌株。从图1中曲线的趋势并没有明显下降可以看出此细菌具有降解苯酚的能力，而曲线末端有一点下降的趋势，则是因为在培养液中有少部分的细菌死亡。
图1 不同时间苯酚溶液耐酚细菌OD值
W1菌株在苯酚为75mg/100mL的平板上有大量菌落生长，根据图2可计算出苯酚降解率为91%～100%，W2菌株在苯酚为60mg/100mL的平板上有大量菌落生长，根据图2可计算出苯酚降解率为81%～90%，W3号菌株在苯酚为45mg/100mL的平板上有大量菌落生长，根据图2可计算出苯酚降解率为71%～80%，如表2所示。
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0][OD值][苯酚含量（mg）][0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06]
图2 不同酚含量标准溶液的OD值
表2 耐酚细菌生长情况及苯酚降解率
[菌株＼&不同含酚浓度平板上生长情况＼& 苯酚降解率 ＼&0.025%＼&0.045%＼&0.060%＼&0.075%＼&<70%＼&71%～80%＼&81%～90%＼&91%～100%＼&W1＼&+＼&+＼&++＼&+++＼&＼&＼&＼&√＼&W2＼&+＼&++＼&+++＼&++＼&＼&＼&√＼&＼&W3＼&++＼&+++＼&++＼&+＼&＼&√＼&＼&＼&]
注：“-”表示没有菌落生长，“+”表示有少数菌落生长，“++”表示有中等菌落生长“+++”有大量菌落生长。
3 展望
本文分离纯化得到3株具有较强降解酚能力的菌株，并对其降酚特性进行了初步的研究。在今后的工作中，应进一步研究其与好氧工艺配合的降解能力，达到降解有毒底物所用时间较短；进一步研究菌株降解底物特性，并从生化机理上进行深入研究；通过各种育种手段提高菌的降解能力，如进行构造基因工程菌，优化细胞培养工艺，诱变育种，进而将其应用到工厂、焦化厂等污水处理方面，降低含苯酚的废水排出，达到改善环境的目。
参考文献
[1]刘相伟.工业含酚废水处理技术的现状与进展[J].工业水处理，1998（02）：1-4.
[2]周定，侯文华.固定化微生物生物处理含酚废水研究[J].环境科学，1990，11（1）：126.
[3]孙福来.土壤有机污染物研究进展[J].农业环境与发展，2002（5）：29-31.
[4]陈明，张维.醋酸钙不动杆菌PHEA22对苯酚降解特性研究[J].中国环境科学，2001，21（3）：226-229.
[5]Lee S G，Hung S P，Removal and bioconversion of phenol in waster water by z-thermostable β tyrosine[J].Enzyme and microbial technology，1996（19）：374-377.
[6]向述荣，陈秀荣.苯酚降解菌phen8的分离筛选及其16SrDNA序列分析[J].微生物学杂志，2002，22（6）：19-20.
（责编：张宏民）
