盐酸川芎嗪在长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞氧化应激中的作用

赵敏玲，刘仲荣，陈胡林，朱英杰，严苗苗，范秀针

(1.广州军区广州总医院皮肤科广东广州510010；2.广州中医药大学广东广州510405)

·基础研究·

盐酸川芎嗪在长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞氧化应激中的作用

赵敏玲1,2，刘仲荣1，陈胡林1，朱英杰1，严苗苗1，范秀针1

(1.广州军区广州总医院皮肤科广东广州510010；2.广州中医药大学广东广州510405)

目的：探讨盐酸川芎嗪（2,3,5,6-tetramethylpyrazine，TMP）在长波紫外线（Utraviolet A,UVA）诱导人皮肤成纤维细胞(Human dermis fibroblasts,HDF)发生氧化应激反应中的保护作用。方法：原代培养HDF细胞，用不同浓度TMP分别作用未经UVA照射以及经UVA多次照射的HDF细胞24 h，48 h，72 h，CCK-8法检测TMP对HDF细胞体外增殖的作用；流式细胞术检测不同浓度TMP对多次UVA照射后HDF细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)总量的影响。结果：TMP在一定浓度范围内对HDF细胞的体外增殖无明显促进或者毒性作用，但对多次UVA照射后HDF细胞的体外增殖有一定的促进作用，且与浓度有一定的相关性，与UVA对照组比较有统计学意义（＜0.05）；TMP可清除UVA多次照射引起的HDF细胞内ROS累积，与UVA对照组比较有统计学差异（＜0.05），其作用效果能达未经UVA照射的水平。结论：盐酸川芎嗪(TMP)对长波紫外线诱导HDF细胞氧化应激有一定的保护作用。

HDF细胞；盐酸川芎嗪；增殖；ROS

紫外线长期慢性反复照射可使皮肤出现松弛、干燥粗糙、皱纹增多等光老化的表现[1]。皮肤光老化现象与成纤维细胞(Human dermis fibroblasts, HDF)的数量减少及分泌合成功能下降或异常有关。日光中的长波紫外线（Utraviolet A,UVA）能穿透表皮，直达真皮层，直接损失成纤维细胞。UVA反复照射可使成纤维细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)堆积，超过了其清除能力，打破氧化与抗氧化平衡，发生氧化应激反应，调节一系列程序化的细胞反应[2]，甚至调控衰老相关的信号通路，促进细胞衰老的发生。有研究表明ROS在细胞内的堆积是皮肤光老化发生发展过程中的重要环节[2]。

川芎嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine, TMP)，是川芎中的主要活性生物碱。研究表明[3]川芎能有效地抑制氧自由基产生，保护膜脂质不被氧化，防止DNA损伤发生。现代药理学研究发现盐酸川芎嗪具有可清除ROS[4]，抗氧化应激[5]，抗肿瘤[6]等作用。

本实验研究盐酸川芎嗪对UVA多次照射后成纤维细胞的体外增殖及胞内ROS的影响，试图为其进一步成为潜在的光防护成分并应用于抗皮肤光老化提供一定的理论依据。

1　材料和方法

1.1主要仪器和试剂

UVA台式紫外线治疗仪（上海希格玛公司，SS-04A）；UVA辐射探测仪（上海希格码公司）；酶标仪（Thermo）；流式细胞仪（Guawa）；ROS试剂盒（Life Sciences）；高糖DMEM(含10%胎牛血清，Hyclone)，CCK-8试剂盒（Sigma），盐酸川芎嗪注射液购自哈尔滨三联药业有限公司，国药准字H20030553。

1.2细胞培养

HDF为原代培养的人皮肤成纤维细胞，取自门诊健康青年男（年龄18～23岁）包皮环切术后进行标本分离的包皮组织，采用酶消化法分离留取HDF细胞进行原代培养，连续传代，取第3～10代的细胞进行实验。

1.3细胞分组和UVA照射

实验分组：20μg·ml-1盐酸川芎嗪组、50μg·ml-1盐酸川芎嗪组、100μg·ml-1盐酸川芎嗪组、UVA组（高糖DMEM培养液+UVA照射）、假照射组（高糖DMEM培养液，置UVA治疗仪下不开电源），未给药组。HDF细胞接种于直径30mm的培养皿中，接种密度为1×104个/皿，置37℃，5%CO2培养箱中培养至刚开始出现融合时进行UVA照射，利用UVA辐射探测仪检测UVA的强度调整照射时间使照射剂量为10J，每日1次，连续照射5次。照射前吸出培养液，PBS洗涤1次，再以PBS覆盖细胞，置于冰上照射。

1.4CCK-8法检测细胞体外增殖活性

取未经UVA照射及5次UVA照射后的HDF细胞，调整浓度为3.0×103个/ml接种于96孔板，每孔100μl，每组设3个复孔，培养24h,48h,72h后，吸去每孔旧培养液（避免药物吸光性影响OD值），加入新鲜培养液（均无药物）100μl/孔，每孔再加入10μlCCK-8试剂，置37℃培养箱中避光孵育2h后，酶标仪测定在450nm波长处每孔的OD值。实验重复5次。

1.5流式细胞术检测HDF细胞内ROS

取未经UVA照射及5次UVA照射48h后的HDF细胞，调整浓度为104个/ml，每1ml细胞悬液加入400μl DCFH-DA(10μM)，以每孔200μl的量接种于96孔板中，每组设双复孔，置37℃培养箱中避光孵育20min上流式细胞仪，488nm为激发波长，525nm为发射波长。实验重复3次。

1.6统计学处理

2　结果

2.1盐酸川芎嗪对未经UVA照射的HDF细胞体外增殖活性的影响

与未给药组（Non-administered）比较，盐酸川芎嗪各浓度组的细胞增殖活性在24h,48h,72h并无明显差异（均＞0.05）。盐酸川芎嗪在一定浓度范围内对HDF细胞的体外增殖活性无明显促进或者毒性作用。见表1，图1。

2.2盐酸川芎嗪对5次UVA照射后HDF细胞体外增殖活性的影响

与假照射组（Sham-irradiated）比较，盐酸川芎嗪各浓度组细胞增殖活性显著降低，差异均有统计学意义（均＜0.05）。与UVA组比较，UVA+盐酸川芎嗪100μg·ml-1组的差异有统计学意义（均＜0.05）。盐酸川芎嗪各组随浓度的增加,细胞增殖活性逐渐增加，且有一定浓度依赖性。盐酸川芎嗪对UVA照射后的HDF细胞表现出一定的光保护作用。见表2。

表1　不同浓度盐酸川芎嗪对未经UVA照射的HDF细胞体外增殖活性的影响

表1　不同浓度盐酸川芎嗪对未经UVA照射的HDF细胞体外增殖活性的影响

注：*与Non-administered比较＜0.05。

组别Non-administered TMP20μg·ml-1TMP50μg·ml-1TMP100μg·ml-1频数OD值5 5 5 5 24 h 0.460±0.046 0.399±0.086 0.456±0.020 0.432±0.010 48 h 0.707±0.067 0.832±0.007 0.777±0.038 0.792±0.053 72 h 0.922±0.063 0.965±0.268 1.111±0.070 1.041±0.077

表2　盐酸川芎嗪对5次UVA照射后HDF体外增殖活性的影响

表2　盐酸川芎嗪对5次UVA照射后HDF体外增殖活性的影响

注：*与Sham-irradiated组比较＜0.05；△与UVA组比较＜0.05

组别UVA组UVA+TMP 20μg·ml-1UVA+TMP 50μg·ml-1UVA+TMP 100μg·ml-1Sham-irradiated频数OD值5 5 5 5 5 24 h 0.486±0.021*0.534±0.007*0.526±0.044*0.515±0.080*△0.708±0.051 48 h 0.631±0.041*0.673±0.086 0.779±0.044*0.778±0.063△0.853±0.054 72 h 0.786±0.039*0.779±0.056*0.825±0.040*0.923±0.050*△1.086±0.096

图1　不同浓度盐酸川芎嗪对未经UVA照射的HDF细胞体外增殖活性的影响

图2　盐酸川芎嗪对5次UVA照射后HDF细胞内ROS的水平影响

2.3盐酸川芎嗪对5次UVA照射后HDF细胞内ROS的影响

与假照射组比较，UVA+不同浓度川芎嗪组细胞内ROS水平无统计学差异，而假照射组与UVA组有统计学差异（＜0.05）。与UVA组比较，其余各组细胞内ROS水平显著降低，差异均有统计学意义（均＜0.05），但无无明显浓度依赖性。盐酸川芎嗪能在一定浓度范围内清除反复UVA照射引起HDF细胞内的ROS累积，以浓度为50μg·ml-1、100μg·ml-1时明显，且能清除至与假照射组接近的ROS水平。见表3、图2。

表3　盐酸川芎嗪对5次UVA照射后HDF细胞内ROS的水平影响

表3　盐酸川芎嗪对5次UVA照射后HDF细胞内ROS的水平影响

注：*：Sham-irradiated组与UVA组有统计学差异（*＜0.05）；△：UVA组与其余各组比较均有统计学差异（△＜0.05）

组别UVA组UVA+TMP20μg·ml-1UVA+TMP50μg·ml-1UVA+TMP100μg·ml-1Sham-irradiated频数3 3 3 3 3 ROS(%) 39.31±6.79*31.47±3.19△23.64±3.51△25.41±4.52△24.01±5.62△

3　讨论

皮肤光老化是紫外线长期反复慢性照射引起的皮肤损害，不但会影响美观，而且会影响皮肤的功能，甚至成为某些皮肤病的相关因素。皮肤光老化临床上表现为皮肤干燥、深皱纹、粗糙、皮革样、点状色素沉着或色素减退斑点、肤色灰黄。组织学上的改变以表皮萎缩、黑色素细胞数量减少且分布局限、胶原纤维、弹力纤维组织结构缺失、无定形弹力蛋白样物质的沉积以及毛细血管扩张为特点。成纤维细胞是真皮层的最重要细胞，在对抗皮肤光老化的发生发展方面起着重要作用，它可产生胶原蛋白、纤维黏连蛋白、糖胺聚糖等细胞外基质，维持皮肤的弹性及水分。长波紫外线的主要作用靶点是成纤维细胞。长期反复紫外线照射引起成纤维细胞生长缓慢，细胞分泌及合成功能下降或异常，同时诱导细胞发生氧化应激反复，导致细胞内活性氧（ROS）的堆积。活性氧是指一类具备氧化能力的的离子、分子和自由基，可分为自由基成分(如超氧自由基和经自由基)及非自由基成分(单线态氧和过氧化氢)。生理情况下细胞内活性氧的生成与代谢处于平衡状态，但在病理状态下会出现失衡从而对细胞造成损伤。ROS可刺激细胞表面细胞因子和生长因子受体的活化导致相应细胞内信号蛋白募集，从而激活多种信号传导通路，导致多种转录因子（如NF-kB），活化的NF-kB会转移到细胞核中，然后在这些特定基因的促进区或增强区与它的同源DNA结合位点相结合，从而开始基因的转录激活表达，它可使衰老相关蛋白p53的表达上调或增加其稳定性[7-8]，并促进基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)表达[9-10]，降解皮肤内胶原纤维，从而促进皮肤衰老现象的发生。

近年来针对氧化应激反应的抗皮肤光老化或光保护剂研究非常多[11]，如人参皂甙Rd[12]、雷公藤红素[13]、红景天[14]等均有明显抗氧化及抗衰老作用。盐酸川芎嗪（TMP）是从传统中药川芎中提取出来的活性生物单体，其清除氧自由基的作用早被证实[4]，在心血管系统、泌尿系统、神经系统方面的作用早有研究，但尚未有文献报道其对皮肤的作用。本研究选用盐酸川芎嗪作为研究对象，以UVA多次照射HDF细胞，探讨盐酸川芎嗪对UVA诱导HDF细胞发生氧化应激的保护作用。结果显示不同浓度盐酸川芎嗪对HDF细胞的体外增殖活性无明显作用。有文献报道[15-16]，盐酸川芎嗪能抑制成纤维细胞的体外增殖且在浓度为250μg·ml-1时成纤维细胞增殖抑制率为50%，但其在浓度为100μg·ml-1以内的作用不明显，本研究中选取的药物作用浓度为0～100μg·ml-1，与雷水生、曹灵等[16-17]研究结论大致相符。更重要的是，本研究发现盐酸川芎嗪对多次UVA照射后的HDF细胞增殖活性有促进作用，具有一定的剂量依赖性，同时检测HDF细胞内ROS水平，结果发现盐酸川芎嗪能清除UVA照射后的HDF细胞内ROS，清除效果能接近假照射组的ROS总量值。这种现象提示在紫外线诱导成纤维细胞损伤，生长缓慢甚至停滞的过程中，ROS可能起到重要的作用。盐酸川芎嗪可能通过清除细胞内ROS，减轻细胞内氧化应激反应的程度，间接促进反复UVA照射后的HDF细胞增殖，发挥了一定的保护作用。

皮肤老化是在细胞衰老的基础上发生的。细胞衰老涉及复制衰老和应激诱导的提前衰老。长期慢性紫外线照射成纤维细胞可引起细胞应激性衰老，其过程涉及氧化应激、细胞自噬、凋亡等一系列过程[17]。细胞内ROS的累积是其中一个重要环节。本研究证实盐酸川芎嗪能在一定程度上改善反复UVA照射引起HDF细胞的增殖缓慢，清除细胞内ROS。因此，笔者推测盐酸川芎嗪可能为潜在的光保护剂，甚至可能具有抗皮肤光老化的作用，这些推测有待进一步研究论证。

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编辑/张惠娟

The Role of 2,3,5,6-tetramethylpyrazine in protecting human dermis fibroblasts from UVA

ZHAO Min-ling1,2,LIU Zhong-rong1,CHEN Hu-lin1,ZHU Ying-jie1,YAN Miao-miao1,FAN Xiu-zhen1
（1.Department of Dermatology,General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA,Guangzhou 510010,Guangdong,China;2.Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405,Guangdong,China）

ObjectiveThestudywaspurposedtoresearchtheprotectionof2,3,5,6-tetramethylpyrazine(TMP)against ROS in human dermis fibroblasts induced by UVA.Methods We first isolated human dermis fibroblasts(HDF)from human prepuce for primary culture,then exposed HDF under repeated ultraviolet A radiation.After 24h,48h,72h,we test the effects of TMP with different concentrations on HDF in vitro proliferation.We also detected the total ROS in HDF after repeated UVA by flow cytometry.ResultsTMP made no effects on HDF in vitro proliferation,but had a certain role on HDF proliferation after repeated UVA,which had a certain correlation with concentration,and there was a significant difference when compared with the UVA control group (＜0.05).TMP was able to eliminate ROS induced by UVA,which had a significant difference when compared with the UVA control group(＜0.05)and return the total ROS to that before UVA radiation.ConclusionTMP was capable of protecting HDF from UVA,which might be related to the elimination of ROS.

HDF;2,3,5,6-tetramethylpyrazine;proliferation;ROS

R758.1

A

1008-6455（2015）03-0030-05

国家自然科学基金（30972652），广东省自然科学计划项目（2013B021800053）

刘仲荣，副主任，副主任医师，主要研究方向为皮肤光老化激光美容；通联：广东省广州市广州军区广州总医院皮肤科，邮编：510010

2014-11-27

2015-01-09