鱼和虾中组胺残留量HPLC法测定的不确定度评定

余晓薇陈俊玉王碧生方成俊潘迎芬朱惠娜肖　颖

（1.东山出入境检验检疫局　福建东山　363401；2.东山县水产品检测中心　福建东山　363401）

鱼和虾中组胺残留量HPLC法测定的不确定度评定

余晓薇1陈俊玉1王碧生1方成俊1潘迎芬1朱惠娜2肖颖1

（1.东山出入境检验检疫局福建东山363401；2.东山县水产品检测中心福建东山363401）

利用高效液相色谱法对组胺残留量的检测，建立鱼和虾中组胺残留量的不确定度分析方法，进而对鱼虾中组胺的残留量不确定度进行分析评定。结果表明，HPLC法测定添加水平50mg/kg的组胺残留量的结果可表示为：X=（48.97±3.98）mg/kg，包含因子k=2。

组胺高效液相色谱法不确定度

生物胺是一种由氨基酸在脱羧酶的作用下脱羧后形成的具有生物活性的低分子碱性含氮化合物。少量的生物胺对人体具有着重要的生理作用，但过量的摄取会引起不良反应，如呕吐、头晕、心悸、呼吸困难和高血压等。组胺是生物胺的一种，其对动物毒害作用最强［1］。水产品尤其是一些青皮红肉鱼（如鲐鱼、鲣鱼、沙丁鱼、秋刀鱼和鲭鱼等），其产品腐败或放置较长时间后可产生大量的组胺。因此，一些国家建议用组胺含量作为水产品中微生物腐败的指标［2］。组胺的卫生学毒性问题已受到广泛的重视，许多国家和地区制定了水产品中的组胺限量标准。澳大利亚和欧盟规定水产品及其制品中组胺限量标准不得超过100mg/kg，美国食品药物管理局（FDA）规定水产品中组胺含量不得超过50mg/kg［3］，而我国规定鲐鱼中组胺含量不得超过1 000 mg/kg，其他红肉鱼类中组胺含量不得超过300 mg/kg［4］。对鱼虾中的组胺含量的检测对产品的货架期及安全质量指标确定具有十分重要的意义。该文对鱼和虾中组胺的残留量的不确定度进行分析。

1　材料与方法

1.1材料与设备Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Mettler XS205DU分析天平（瑞典梅特勒公司）；BS 2202S电子天平（北京赛多利斯有限公司）；T25 basic高速均质器（德国I-KA实验仪器公司）；L530台式低速离心机 （湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；SHP-1500低温生化培养箱 （上海精宏实验设备有限公司）；XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）。甲醇、乙腈、丙酮、乙酸铵均为色谱纯（美国Tedia公司）；高氯酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、氨水均为优级纯；丹酰氯：纯度≥99%；盐酸组胺标准物质：纯度≥99.0%（德国Dr.Ehrenstorfer公司）；实验用水为超纯水。

1.2试验方法

1.2.1标准溶液配制准确称取0.01 657 g盐酸组胺标准物质于10mL棕色容量瓶中，用纯水溶解并定容至刻度，得到浓度为1.0 mg/mL的标准储备液；吸取0.1 mL标准储备液至25 mL棕色容量瓶中，并用高氯酸定容，得到浓度为4.0μg/mL的标准使用液，然后按照1.2.2的衍生化步骤反应处理后供HPLC测定。

1.2.2前处理方法提取：称取2 g已绞碎试样（精确至0.01 g）置于50 mL具塞塑料离心管中，加入10mL 0.4mol/L高氯酸溶液，振荡混匀60 s，超声提取10 min后，于4 000 r/min离心5 min，定容至刻度。上清液移入25 mL棕色容量瓶中。沉淀物用10 mL 0.4mol/L高氯酸溶液重复提取一次，于4 000 r/ min离心5min，合并上清液于上述容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定衍生化 移取上述提取液1.0mL 于5 mL棕色容量瓶中，依次加入100μL 2 mol/L氢氧化钠溶液、300μL饱和碳酸氢钠溶液和2 mL 10mg/mL丹酰氯溶液，盖塞混匀，于40℃避光反应45 min。反应完毕后，加入100μL氢氧化铵，静置30 min，用乙腈定容至刻度，混匀后，取部分溶液过0.45μm有机滤膜后，供HPLC测定。检测流程见图1。

图1　检测流程示意图

1.2.3色谱条件色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：0.01 mol/L乙酸铵溶液-乙腈（体积比43∶57）；流速：1.0 mL/min；进样量：20μL；柱温：35℃，检测波长：254 nm。

2　不确定度评定与合成

根据数学模型和检测流程等相关信息［5］，影响测定各个参数不确定度的来源可构建鱼和虾组胺残留测定的因果关系图见图2。

2.1重复测量样品和标准物质产生的相对不确定度u rel（A）

2.1.1样品重复测定产生的相对不确定度 urel（Ax）在2.00 g阴性样品中，加入100μL 1.0mg/kg组胺制成加标样，添加水平为50mg/kg。20次测量结果见表1。

自由度f=20-1=19，灵敏系数=1。

表1　添加水平为50 mg/kg的20次测量结果

图2　鱼和虾组胺残留测定的因果关系图

2.2组胺标准溶液配制引起的相对不确定度urel（B1）标准溶液配制过程：准确称取16.57mg的盐酸组胺标准品，用水溶解后定容到10 mL容量瓶，此溶液为标准储备液1mg/mL；从标准储备液中吸取1 mL至25 mL棕色容量瓶中，并用高氯酸定容，此溶液为标准使用液0.004mg/L。用标准使用液0.004mg/ L衍生后，上机检测以制得浓度-峰面积标准工作液。

2.2.2配制标准溶液体积引入的相对不确定度urel（V）

2.3样品称量引入的相对不确定度urel（B2）样品称取2 g，称样天平（赛多利斯2202S）称量不确定度主要为称量变动性，根据电子天平技术参数，其变动性标准标准偏差为0.01 g，实际操作过程中控制在0.02 g，按照均匀分布则其不确定度为为0.02/31/2= 0.0115，则样品称量的相对不确定度为：urel（B2）= 0.0115/2.00=0.0058。

2.4配制样品溶液体积引入的相对不确定度urel（B3）

则1.00mL刻度吸管的合成体积标准不确定度为：u（V3'）=8.67×10-3。

3　结　果

将A类和B类的相对不确定度进行合成［7］，检测结果Cx为48.9655mg/kg。

U=k uc，取包含因子k＝2（置信水平0.95），则：U=kuc=3.98mg/kg。

根据以上分析，HPLC法测定添加水平50 mg/ kg的组胺残留量的结果可表示为：X=（48.97±3.98）mg/kg，包含因子k=2。

［1］赵利，苏伟，刘建涛，等.水产品中生物胺的研究进展［J］.水产学报.2006.30（2）：272-276.

［2］郝宏兰.水产品中组胺的测定方法研究 ［J］.食品科学，2000，21（8）：46-48.

［3］李志军，薛长湖，封锦芳，等.柱前衍生-RP-HPLC方法测定水产品中生物胺 ［J］.中国海洋大学学报，2007，37（3）：427-431.

［4］GB 2733-2005鲜、冻动物性水产品卫生标准［S］.北京：中国标准出版社，2005.

［5］GB/T20768-2006鱼和虾中有毒生物胺的测定-液相色谱紫外检测法［S］.北京：中国标准出版社，2006.

［6］中国实验室国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南［M］.北京：中国计量出版社，2002.

［7］国家质量技术监督局计量司.测量不确定度的评定与表示指南［M］.北京：中国计量出版社，2000.

Evaluation of uncertainty for determ ining of histam ine in fish and shrimp by HPLC

Yu Xiaowei1Chen Junyu1Wang Bisheng1Fang Chengjun1Pan Yingfen1Zhu Huina2Xiao Ying1
（1.Dongshan Entry&Exit Ispection and Quarantine Bureau，Fujian 363401；2.Dongshan Aquatic Products Test Center，Fujian 363401）

Establish the evaluation of the uncertainty of histamine in fish and shrimp by HPLC.The result showed that∶histamine can be expressed by X=（48.97±3.98）mg/kg ataddition level of 50mg/kg by using a coverage factor k=2.

Histamine HPLC Uncertainty

A

1003-4331（2015）01-0003-04

福建省出入境检验检疫局科技项目（FK2012-13）资助。

余晓薇，女，福建宁德人，从事食品检测工作。