羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立与初步应用

陈小丽　福建省三明市农业局　福建三明　365000

羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立与初步应用

陈小丽福建省三明市农业局福建三明365000

根据羊传染性脓疱病毒（CPDV）B2L基因序列，设计合成一对引物，建立了检测羊传染性脓疱病毒DNA的PCR检测方法。特异性、敏感性试验表明，该方法可以检测2 pg DNA；并能与羊痘病毒、口蹄疫病毒进行鉴别区分；结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性，可对临床组织病料中的CPDV进行快速检测。

羊传染性脓疱病毒PCR特异性敏感性

羊传染性脓疱，俗称羊口疮，是由痘病毒科、副痘病毒属的传染性脓疱病毒 （contagious pustular dermatitis virus，CPDV）引起的各类羊的一种急性、接触性的传染病［1］。该病主要危害羔羊，表现为急性接触性传染。患羊以口腔黏膜出现红斑、痘疹、水疱、脓疱，继之真皮结缔组织高度增生，形成疣状痂块为特征。该病为人兽共患病，主要是通过接触引发感染，动物发病主要是口唇、舌、鼻和乳房等处的皮肤及黏膜出现一些水泡、溃疡、结成厚厚的结痂等症状，受威胁的羊群发病率很高，通常都达到90%左右，但是病死率不高，只有25%或以下［2］，虽然病死率不高，但会引起发病羊只采食困难，还会影响发病母羊的乳量和乳质，造成羊场的经济损失。

目前，诊断CPDV的方法有很多种，比如电子显微镜检查、病毒分离、接种试验等［3-6］，而常规的病原学分离和血清学检测方法，又存在操作繁杂、费时费力、敏感性低等不足。由于CPDV的临床发病症状与口蹄疫、羊痘症状很像，在加上此病还容易继发感染一些细菌或病毒性的疾病，临床经验不丰富的兽医工作人员容易误诊。本研究旨在建立一种快速、准确、特异性高的PCR检测方法，为羊口疮的快速诊断提供了一种简便、快速、准确的方法，从而满足基层快速检疫的需要。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料与毒株临床病料来自三明各县 （市、区）收集的发病山羊的疑似病例；口蹄疫灭活疫苗购自金宇保灵生物药品有限公司；山羊痘病毒标准弱毒株（B株）购自中国兽医药品监察所；已经提取出DNA的羊口疮病毒由试剂公司赠送；健康山羊皮肤由本单位实验室低温冰箱保存。

1.1.2试剂核酸提取试剂盒、PCR试剂等购自大连宝生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1引物设计根据GenBank中CPDV全基因序列，选择B2L基因序列作为本试验的扩增区，设计1对引物。引物序列为P1：5'-AGCGTGCGGTAGAAGCCCAGGAA-3'，P2：5'-GCGGCGGGCATCAACTACTACAAA-3'，预计扩增目的片段大小为362 bp，引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.2.2病毒DNA的提取试剂公司赠送已提取出的DNA的羊口疮病毒样品备用。羊病变皮肤组织用20mmoL/L PBS洗涤后，用灭菌剪刀剪碎后，加入钢珠进行匀浆，反复冻融2～3次，10 000 r/min离心10 min，收集上清备用。以上样品各取500μL用柱纯法提取DNA，提取出的DNA用50μL DEPC水溶解后即可用作PCR模板，放入冰箱冷冻保存备用。

1.2.3PCR扩增反应的总体积为50μL，即25.0 μL的 2×PCR预混合物、2.0μL的上游引物（10 pmol/μL）和2.0μL的下游引物、1.0μL的DNA模板、20.0μL的DEPC水。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min，接下来35个循环 （94℃变性1 min，55℃退火30 s和72℃延伸30 s），最后72℃延伸10min。对扩增出的产物在加入gold view染色剂的1%琼脂糖凝胶液中进行电泳，电泳产物用凝胶成像系统观察结果。

1.2.4PCR扩增的特异性用建立的PCR方法分别检测羊口疮病毒、临床疑似病料、羊痘病毒、口蹄疫病毒和健康羊组织。

1.2.5PCR扩增的敏感性以羊口疮病毒DNA为样本，测定OD260nm值，计算DNA的含量，然后将DNA 10倍比稀释，进行PCR扩增，以检测所建立方法的敏感性。

1.2.6临床样品的检测用建立的PCR方法对从三明市各县（市、区）收集的16份病料进行检测。

2　结　果

2.1PCR扩增经PCR扩增，出现1条特异性扩增条带（见图1），与预期的目的片段大小一致（约362 bp）；健康的羊皮组织未扩增出条带。结果和预期一致，说明该方法可以用于羊口疮病毒的扩增。

图1　PCR扩增结果（M：DNA Ladder 2000；1：疑似发病羊群的病料；2：正常羊皮组织；3：阴性对照）

2.2PCR的特异性利用PCR方法，对已知的羊口疮病毒、临床发病的疑似病料、健康的羊皮组织、口蹄疫病毒和羊痘病毒一同扩增。结果显示，已知羊口疮病毒和临床疑似病料有1条大约是362 bp的条带，其他的样品孔没有跑出任何的条带显示阴性（见图2）。说明建立的PCR方法具有良好的特异性，与羊痘病毒、口蹄疫病毒等病毒核酸不能发生特异性结合。

2.3PCR扩增的敏感性对DNA进行10倍比稀释，进行PCR扩增，结果当DNA模板为2 pg时仍可见清晰的目的扩增条带，说明建立的PCR方法具有较好的敏感性，微量的病毒含量也可被检出 （见图3）。

图2　PCR特异性试验（M：DNA Ladder 2000；1：已知的羊口疮病毒样品1；2：疑似发病羊群的病料2；3：羊痘病毒；4：口蹄疫病毒；5：健康羊组织；6：阴性对照）

图3　PCR敏感性试验（M：DNA Ladder 2000；1：2 000 ng；2：200 ng；3：20 ng；4：2 ng；5：200 pg；6：20 pg；7：2 pg；8：0.2 pg；9：0.02 pg）

2.4临床样品的检测对从三明市收集的2个规模养羊场16头临床发病羊的病样进行检测，15份PCR扩增均为CPDV阳性，检出率为94%，说明临床检出率高，建立的PCR方法适合于临床诊断。

3　讨　论

羊口疮是发生在羊身上的一种常见病，虽然病死率不高，但发病率较高，一旦羊场染上该病很难根治，势必影响羊的生产和发育，最终造成经济损失。羊口疮的临床表现与羊痘和羊口蹄疫都很相似，经验不丰富的养殖户很容易混淆而造成误诊。本单位中心实验室使用的PCR方法检测羊口疮病毒DNA具有特异性好的特征，同时对羊口疮、口蹄疫、羊痘这几种在临床上容易混淆的病毒都用该方法扩增条带，结果只发现羊口疮有扩出特异性的目的条带，其他疫病并未扩出条带。

近几年来，三明的羊养殖规模一直在扩大，从散户变成小养殖户、小养殖户转变为大养殖户。三明市12个县（市、区）年出栏率100头以上的养羊场达200多个，平均一个县就有20个左右的羊场。小小的一个三明市，面对这么庞大的羊养殖户，我们的人力物力疲于应对。目前本单位中心实验室了解的信息是，大型羊场管理规范，疫病的防控措施得当，羊口疮发生情况较少，但是小型羊场卫生、防疫条件都比较落后，许多散户和小型场缺乏专业知识，常把羊口疮误诊为其他疾病，治疗措施不当，已经被羊口疮困扰多年了。这些养殖户有个共同的特点就是临床发病不严重，有的只是出现一些轻微的症状，口唇边缘长结痂，一般不会造成死亡，养殖人员比较麻痹大意，有时不管理，时间一长轻微的口疮症状也能自行消失，有的养殖人员用竹片刮结痂、刮到患处有血丝即可，并在患处涂抹2%紫药水。几天后症状就能消失，但过一段时间又会复发，反反复复给养羊业带来了经济损失。

总之，羊口疮可防、可控、可治疗，但也不能掉以轻心。养殖过程中一定要做好环境卫生、注意动物的营养搭配，提高动物抵御疾病的能力，同时，对一些该病的高发区还应做好疫苗的防疫，定期对羊群进行监测检查，分析评估防疫的效果，从而从源头上杜绝该病的发生。

［1］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.北京：科学出版社，1997.

［2］何水林，陈杰，蔡玉书，等.羊口疮病毒的分离与鉴定［J］.中国兽医科技，2002，9（3）：21-23.

［3］白积荣，沈正达，王锡贞，等.羊口疮病毒形态发生的电镜观察［J］.中国兽医科技，1985（11）：34-36.

［4］张素珍，张惠安，邝明慧，等.羊口疮病原的分离与鉴定的研究［J］.中国兽医科技，1987（4）：3-4.

［5］陈燕军.羊口疮的研究血清学方法的研究［J］.兽医科技杂志，1982（7）：14-19.

［6］庞理化，程庆华，侯秀芬，等.羊口疮病毒组织培养初报［J］.青海畜牧兽医杂志，1982（3）：66-69.

Development and application of the PCR method for CPDV detection

Chen Xiaoli
（Sanming city agriculture bureau，Fujian 365000）

A PCR assay for the rapid and sensitive detection of CPDV was developed by using a pair of primers designed according to the published B2L gene sequence of CPDV.The sensitivity of the assay can be up to 2 pg.The result of amplification with CPV、FMDV were negative.The result showed that the assay was specific and highly sensitive，and can be used for fast diagnosis and epidemic survey.

CPDV PCR specificity sensitivity

A

1003-4331（2015）01-0013-03