荧光定量PCR法检测点带石斑鱼神经坏死病毒研究

彭智发　福建省泉州市洛江区动物疫病预防控制中心　福建泉州　362011

荧光定量PCR法检测点带石斑鱼神经坏死病毒研究

彭智发福建省泉州市洛江区动物疫病预防控制中心福建泉州362011

根据己公布的神经坏死病毒全基因序列，应用引物设计软件依据GeneBank所收录的各种石斑鱼神经坏死病毒RNA2基因组全序列选择保守区域，根据Taqman探针引物设计原则，设计TaqMan探针及其引物。采用TaqMan探针技术，并且将假病毒技术构建的含有神经坏死病毒RNA2基因组的MS2噬菌体假病毒作为阳性质控品，建立TaqMan探针检测点带石斑鱼神经坏死病毒的荧光定量PCR方法，拟合标准曲线，能够在病毒检测中进行绝对定量，能检测到10个病毒拷贝模板数，在临床检测中得到很好运用。本研究建立实时荧光定量RT-PCR，有助于日常检验工作，为鱼类神经坏死病毒的筛选和监测提供基础，有助于控制神经坏死病的疫情传播。

荧光定量PCR点带石斑鱼神经坏死病毒（NNV）

鱼类病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis，VNN）又称病毒性脑病和视网膜病（viral encephalopathy and retinopathy，VER），其致病原为神经坏死病毒（Nervous Necrosis Virus），是世界范围的一种鱼类流行性传染病，对仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达100%，对成鱼也有很高的致死率。由于其极高的传染性和危害性，被国际兽疫组织（OIE）列为重要的鱼类病害［1］。该病毒为两条单股RNA，分别为RNA1和RNA2，其中RNA1的功能为 RNA-dependent RNA polymerase（RdRp），RNA2则可以转录翻译出病毒的外壳蛋白［2-4］。近几年在我国南方各省养殖的各种石斑鱼常常暴发流行VNN，给石斑鱼养殖业造成很大的经济损失［5-7］，建立一种快速、安全的检测方法已经迫在眉睫。Taq-Man荧光探针定量PCR技术己广泛应用于临床病原微生物的诊断领域，不但提高了PCR的检测灵敏度，还能对模板进行准确定量检测，特别适用于动物传染病的诊断和检测。本研究的目的是建立实时荧光定量RT-PCR技术，用于临床NNV快速诊断。

1　材　料

1.1病料疑似患病点带石斑鱼鱼苗来自福建省漳州市某石斑鱼育苗场，经RT-PCR方法检测证明是NNV阳性。活体采集患病鱼苗，整鱼冻存于-80℃冰箱备用。

1.2引物和探针应用引物设计软件依据GeneBank所收录的各种石斑鱼神经坏死病毒RNA2基因组全序列选择保守区域同时设计Taq-Man探针及其引物。探针和引物由上海生物工程有限公司合成。正向引物：GGACCTCGTCGGGAAAGGAG，反向引物：GACACAGCACTGACACGTTGA，探针：CGTCACCTGGTCGGCTGATACTCCTGT。探针的荧光标记选择FAM作为报告基团，TAMRA为淬灭基团。

1.3阳性质控品本实验室保存的采用假病毒技术克隆的含石斑鱼NNV编码主衣壳蛋白的RNA2基因片段的MS2噬菌体。病毒RNA基因组取自点带石斑鱼神经坏死病毒编码MCP的RNA2，扩增片段长为 635 bp，用于扩增的正向引物为：5'-ACAACGATCACACCTTCGACG-3'，反向引物为：5'-AACCGGATGACCCGGTTAGTT-3'。

1.4仪器和试剂PE7300荧光定量PCR仪、PE9700PCR仪购自PE公司；Hotstart-Taq酶购自厦门泰京生物技术有限公司；RNA抽提试剂盒以及RT-PCR试剂购自Promega公司。

2　方　法

2.1标准品制备MS2噬菌体阳性质控品，用紫外分光光度计测重组MS2噬菌体质控品浓度，然后按以下公式转换成质粒的拷贝数：拷贝数=质粒浓度×阿氏常数k（一个碱基对的平均分子量×质粒的总长度）。其中，阿氏常数为6.02×1023，一个碱基对的平均分子量为648，重组质粒的总长度为3 659 bp。MS2噬菌体阳性质控品作10倍梯度稀释。用紫外分光光度计测定MS2噬菌体阳性质控品的OD值，计算其浓度，并依次稀释成含质粒数量分别为1010、109、108……101、100个拷贝，共10个样品梯度作为标准品，-70℃保存备用。

2.2实时荧光定量RT-PCR反应采用一步法在定量荧光PCR仪上完成cDNA和RT-PCR过程。反应体系为25μL，其中含核酸模板5μL，M-MuLV逆转录酶（20 U/μL）0.15μL，RNA酶抑制剂（20 U/ μL）0.2μL，Taq酶（5 U/μL）0.2μL，正、反向引物各0.2μL（40μmol），TaqMan探针0.2μL（40μmol），dNTP 0.2μL，10×Taq酶缓冲液 2.5μL，MgCl2（25mmol）2.5μL，加灭菌双蒸水至25μL。PCR程序设定为：42℃ 30 min、95℃ 5 min，然后95℃20 s、58℃40 s循环40次。阴性控制用DEPC处理的双蒸水作模板。

2.3实时荧光定量RT-PCR的特异性用建立的RRT-PCR同时检测神经坏死病毒（NNV）、真鲷虹彩病毒 （RSIV）、虾白斑病毒 （WSSV）、猪圆环病毒（PCV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、沙门氏菌（Salm），并设立阳性和阴性对照。观察实时荧光定量RT-PCR反应的特异性。

2.4MS2噬菌体阳性质控品的重复性与稳定性测试对MS2噬菌体阳性质控品在同样条件下以4个不同浓度梯度，同时进行4次重复检测，测定组间变异系数，并判断MS2噬菌体阳性质控品的重复性和稳定性。

表1　MS2噬菌体阳性质控品重复检测曲线Ct值

2.5MS2噬菌体阳性质控品线性范围的确定通过MS2噬菌体阳性质控品的梯度依次进行10倍稀释，同时取5～8个梯度同时进行RRT-PCR，观察荧光扩增曲线图和Ct值，以确定MS2噬菌体阳性质控品良好扩增的线性范围。

2.6MS2噬菌体阳性质控品标准曲线的建立通过已确立能够进行良好扩增的MS2噬菌体阳性质控品的稀释梯度范围，拟合曲线生成一条线性方程（y=kx+b），为绝对定量做好铺垫。

2.7临床病料的实时荧光定量RT-PCR检测以建立的实时荧光定量RT-PCR方法临床检测疑似含有神经坏死病毒的鱼苗肝脏及脑组织样品。

3　结　果

3.1实时荧光定量RT-PCR的特异性测试用建立的RRT-PCR同时检测神经坏死病毒 （NNV）、真鲷虹彩病毒（RSIV）、虾白斑病毒（WSSV）、猪圆环病毒（PCV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、沙门氏菌（Salm），并设立阳性和阴性对照。结果表明，只有神经坏死病毒呈阳性，其他结果均为阴性。

3.2RRT-PCR与常规RT-PCR敏感度的比较用本试验建立的快速检测NNV的常规RT-PCR方法检测阳性质控品的5个稀释度，检测结果能达到100 pg级核酸含量。本试验所建立的RRT-PCR则最少可以检测到10拷贝量的病毒量，比RT-PCR方法至少敏感10倍。

3.3MS2噬菌体阳性质控品的重复性与稳定性测试对阳性质控品MS2噬菌体在103～107copies/μL 的5个稀释度进行4次重复检测，每个浓度的Ct值见表1，扩增图见图1，统计学分析其Ct值变异系数（CV）分别为0.20%、0.54%、0.22%、0.03%、0.26%，曲线的回归系数R2为0.997。

3.4MS2阳性质控品线性范围的确定将阳性质控品按109～103copies/μL浓度，按上述体系和反应进行扩增，结果如图2。筛选出以107-103copies/μl为理想浓度，浓度过高或过低均会对扩增曲线产生影响。本试验建立的RRT-PCR方法最少可以检测到10个病毒拷贝数，在较广的范围内 （103～107copies/μL）Ct值与质粒拷贝数的对数之间呈现良好的线性关系，相关系数值R2=0.997。

3.5MS2噬菌体阳性质控品标准曲线的建立用MS2噬菌体阳性质控品进行扩增，拟合出一条标准曲线，斜率为-3.392，截距为7.829，从而可以得出拷贝数（Copy number）与循环阈值（Ct）之间的线性关系曲线表达式：Ct=-3.392lgCopy number+7.829，而待测样品的Ct值可以从仪器中读取；把待测样品的Ct值代入表达式就可以算出其初始拷贝数。从建立的标准曲线可知，相关系数R2=0.997，证明试验误差较小，该标准样品作为荧光定量标准品是合格的（见图2-图3）。

图1　MS2阳性质控品在浓度为103～107copies/μL的实时荧光定量扩增曲线图

图2　MS2噬菌体阳性质控品扩增曲线图

3.6临床病料的实时荧光定量RT-PCR检测用建立的NNV RRT-PCR检测疑似病毒性神经坏死病的点带石斑鱼临床样品，并观察扩增曲线。结果显示（见图4）：阴性对照样品无Ct值或无扩增曲线，阳性对照107拷贝 （MS2噬菌体阳性质控品）Ct值为19.87，符合判定标准，表明阴性对照和阳性对照成立。样品1～5的Ct值及结果判断分别为：20.89（阳性）、22.57（阳性）、24.02（阳性）、27.15（阳性）。

4　讨　论

聚合酶链式反应技术（PCR）问世以来，凭其灵敏性、特异性和快速性广泛应用于分子生物学等领域。TaqMan-MB荧光探针定量PCR技术已经在临床病原微生物的诊断领域得到广泛应用，在动物传染病方面的诊断，能定量检测病毒在机体内的分布及感染强弱，实现了PCR从定性到定量的飞跃，以特异性强、速度快、重复性好、定量准确、灵敏度高及全封闭反应等优点成为分子生物学领域中的重要工具。本研究的目的是建立实时荧光定量RT-PCR技术，用于临床NNV快速诊断，为此，我们根据GeneBank中登录的NNV衣壳蛋白的核昔酸序列设计引物和探针，并优化试验条件和反应体系，通过多次对不同样品的重复性检测，结果显示具有优良的稳定性和可重复性。其敏感性比RT-PCR敏感10倍，最小可检出10个病毒拷贝数。

图3　浓度为103～107copies/μL的阳性质控品的实时荧光定量RT-PCR扩增标准曲线（注：横坐标为质粒的拷贝数以10为底的对数值，纵坐标为循环阈值）

图4　实时荧光定量RT-PCR对临床样品检测曲线图

构建标准品和拟合标准曲线是运用实时荧光定量PCR准确检测样品的前提。本试验采用基因工程手段构建出含有NNV基因片段与包装蛋白形成的蛋白-RNA复合体，即假病毒，用于构建石斑鱼NNV RT-PCR检测的阳性质控品［6］。该阳性对照可以真实体现病毒核酸的提取过程，对病毒的裂解、提取过程进行质控，与待检样品同时完成RNA提取和RT-PCR检测过程。阳性质控品可用来排除由试剂本身失效、操作异常导致的“假阴性”，是进行PCR检测必不可少的因素。制作标准曲线应注意以下几个方面：（1）标准品要精确稀释。（2）DNA要高度纯化。（3）标准品要有强稳定性［8］。本试验选用纯化好的MS2噬菌体阳性质控品作为标准样品，且选用了10个稀释度的样品进行荧光定量PCR扩增，发现起始浓度越高，Ct值越小，因此，起始浓度与Ct值之间具有很好的线性关系，并成功制作标准曲线。

以建立的荧光定量PCR方法同时检测神经坏死病毒（NNV）、真鲷虹彩病毒（RSIV）、虾白斑病毒（WSSV）、猪圆环病毒（PCV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、沙门氏菌（Salm），并同时设立阳性和阴性对照。结果表明，只有神经坏死病毒呈阳性，其他结果均为阴性。证明本研究建立的检测方法具有良好的特异性。对MS2噬菌体阳性质控品在同样的条件下，以4个不同浓度梯度同时进行4次重复检测，得到较低的组间变异系数，因而具有较好的稳定性。同时在较广的范围内（103～107copies/μL），Ct值与质粒拷贝数的对数之间呈现很好的线性关系，相关系数值R2=0.997。建立的Taqman实时荧光定量PCR方法，为鱼类神经坏死病毒研究提供了一种新的检测方法。对鱼类神经坏死病毒的监测是控制并消灭鱼类神经坏死病毒病的重要前提。

［1］世界动物卫生组织 （OIE）.水生动物疾病诊断手册［M］.3 版.北京：中国农业出版社，2000：165-171.

［2］Munday B L，Kwang J，Moody N.Betanodavirus infections of teleost fish：a review［J］.Journal of Fish Diseases，2002，25：127-142.

［3］Ball L A.Requirements for the self-directed replication of flock house virus RNA1［J］.Journalof Virology，1995，69（2）：720-727.

［4］Nakai T，N ishizawa T.Sequence of the non-structural protein gene encoded by RNA1 of striped jack nervous necrosis virus［J］.Journal of General Virology，1999，80：3019-3022.

［5］陈信忠，龚艳清，苏永全，等.闽南地区紫石斑（Epinephelus lanceolatus）幼鱼爆发性传染病的病原学研究［J］.厦门大学学报：自然科学版，2004，43（4）：557-562.

［6］陈信忠，龚艳清，王军，等.实时荧光定量RT-PCR检测石斑鱼病毒性神经坏死病［J］.高技术通讯，2006，16（4）：431-434.

［7］龚艳清，陈信忠，王军，等.福建南部养殖石斑鱼暴发性疾病流行调查［J］.福建农林大学学报：自然科学版，2006，35（5）：532-537.

［8］Stone B，Burrow S J，Schepetiuk S，et al.Rap id detection and simultaneous subtype differentiation of influenza A virusesby real-time PCR［J］.JVirolMethods，2004，117 （2）：103-112.

Research of real-time quantitative RT-PCR detected Epinephelus lanceolatus grouper nervous necrosis virus

Peng Zhifa
（Animal Disease Prevention and Control Center of Luojiang District，Quanzhou，Fujian 362011）

According to the study published by the others nervous necrosis virus gene sequence，application primer design software based on GeneBank contains various grouper nervous necrosis virus RNA genome sequence choose conservative region while TaqMan probe design and primers.TaqMan probe technology，and will leave Construction of the virus containing nerve necrosis virus RNA genome of the virus MS2 bacteriophage as a positive controls，a TaqMan probe brings grouper nervous necrosis virus fluorescence quantitative PCR，and the establishment of a standard curve，which can detect virus testing for absolute quantification，the minimum can detect 10 viruses，In actual use of detection achieved very good results.The establishment of real-time quantitative RT-PCR and contribute to future coastal ports in the day-to-day inspection and fish and nervous necrosis virusmonitoring provided by the foundation，will help to control the nervous necrosis disease spread of the epidemic.

real-time quantitative RT-PCR Epinephelus lanceolatus NNV

A

1003-4331（2015）01-0015-04