PPARα/COX-2/PGE2通路在人结肠癌耐药细胞中的作用研究

聂　芳　赵贤元　余跃天　殷　荣　李昱洁　曹建国　皋　源

PPARα/COX-2/PGE2通路在人结肠癌耐药细胞中的作用研究

聂芳赵贤元余跃天殷荣李昱洁曹建国皋源

目的初步检测PPARα对COX-2蛋白表达和酶活性的影响，推测PPARα/COX-2/PGE2通路在人结肠癌耐药细胞中的可能作用。方法Real-Time PCR和Western blot检测SW1116细胞、SW1116/HCPT细胞，以及下调PPARα表达后SW1116细胞中COX-2的表达差异；ELISA检测WY-14643分别干预SW1116细胞，SW1116/HCPT细胞，以及下调PPARα表达后各组细胞培养上清中PGE2含量；流式细胞术检测不同浓度PGE2对细胞周期的影响。结果COX-2在耐药细胞中表达明显下调。PPARα表达下调抑制COX-2表达。PPARα激动剂WY-14643促进细胞释放PGE2［250 μM：（0.7851± 0.0203）ng/mL vs（0.2443±0.01228）ng/mL，P=0.000；100 μM：（0.5483±0.0614）ng/mL vs（0.2443± 0.01228）ng/mL，P=0.0083］；PGE2降低细胞周期G1期比例，升高S期比例，PI由对照组的（32.2± 2.13）%，上升到（42.2±3.14）%、（52.1±2.43）%，P=0.0123。结论人结肠癌耐药细胞中COX-2表达显著下调；PPARα有促进COX-2蛋白表达和酶活性的作用。

结直肠癌；环氧合酶2；耐药；PGE2；PPARα

【Abstract】Objective To explore the regulation of PPARα to COX-2 protein expression and COX-2 enzyme activity，and to find out the role of PPARα/COX-2/PGE2pathway in drug resistance colorectal cancer cells.Methods The expressions of COX-2 were measured by Realtime PCR and Western blot in SW1116 cells，SW1116/HCPT cells and SW1116 cells transfected with siRNA vectors for silencing PPARα；PGE2concentration in culture supernatants was detected by ELISA in SW1116 cells and SW1116/HCPT cells treated with PPARα agonist WY-14643，SW1116 cells and SW1116/HCPT cells transfected with siRNA vectors for silencing PPARα；cell cycles of SW1116/HCPT cells treated with PGE2were assessed by flow cytometry.Results Protein and mRNA expressions of COX-2 were much lower in SW1116/HCPT cells and SW1116 cells transfected with siRNA vectors for silencing PPARα than in SW1116 cells.PGE2concentrations in cells culture supernatants of SW1116/HCPT cells were elevated after treatment with WY-14643［100 μM：（0.5483± 0.0614）ng/mL；250 μM：（0.7851±0.0203）ng/mL］；proliferation index were elevated in SW1116/HCPT cells with PGE2［10-8mol/L：（42.2±3.14）；10-7mol/L：（52.1±2.43）%；con：（32.2±2.13）%］.Conclusions The expression of COX-2 were much lower in SW1116/HCPT cells than in SW1116 cells.PPARα promoted the protein expression and enzyme activity of COX-2.

【Key words】Colorectal Cancer；COX-2；Drug Resistance；PGE2；PPARα

环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）作为前列腺素合成的限速酶在炎症中起重要作用，而且参与结直肠癌发生、发展及促进其转移与侵袭。COX-2主要表达在新生的血管内皮细胞和形成血管的细胞中，通过影响VEGF参与肿瘤新生血管的形成［1-2］。在人结肠癌羟基喜树碱（Hydroxycamp－tothecin，HCPT）多药耐药细胞株（简称SW1116/ HCPT）中，过氧化物酶体增殖物激活受体α（Peroxisome proliferator-activated receptors-α，PPARα）下调了105倍［3］。进一步研究发现，COX-2的表达在该耐药细胞中也是明显下调的。为了明确PPARα、COX-2在结肠癌细胞中的作用，探讨可能相关的信号通路的效应分子，我们假定PPARα可能在某种程度上发挥对COX-2调节作用，并以此为基础，通过检测COX-2的作用底物PGE2，了解PPARα激动剂WY-14643对COX-2的活性和蛋白表达影响，进一步推测PPARα对COX-2调节的可能机制。

材料和方法

一、材料

1．细胞株和干扰质粒

人结肠癌SW1116细胞株，人结肠癌羟基喜树碱多药耐药SW1116/HCPT细胞株（简称为SW1116/HCPT），由仁济医院消化科冉志华教授提供，该多药耐药细胞株是通过药物浓度梯度法诱导建立［3］，该细胞株冻存前培养于含羟基喜树碱（浓度为1 μg/mL）的RPMI-1640完全培养液，复苏后培养于无羟基喜树碱的RPMI-1640完全培养液3～5代后用于实验。PPARa干扰质粒由课题组童锦禄博士构建完成并保存，载体为p-RNAT-U6.1/neo［4］。

2．主要试剂

脂质体2000（美国Invitrogen公司）；羟基喜树碱（HCPT）：长春天诚药业有限公司；ELISA-PGE2试剂盒：美国R&D公司（货号KGE004）；PGE2：美国SIGMA公司（货号P0409）；WY-14643：（美国SIGMA）；MK-886：（美国SIGEMA）；RKIP：兔抗人多克隆抗体（Santa Cruz，货号sc-28837）；COX-2：山羊抗人多克隆抗体（美国Abcam，货号ab23672）；PPARα：鼠抗人单克隆抗体（美国Abcam公司，货号ab2779）；HRP标记的小鼠抗人GAPDH多克隆抗体（上海康成生物，货号KC-5G5）。

二、主要方法

1．实时荧光定量PCR

（1）Trizol法分别抽提细胞RNA：SW1116细胞和人结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞SW1116/ HCPT细胞，每孔3×105接种于六孔板，待细胞生长汇度达85%～95%时，Trizol法分别抽提两组细胞RNA，紫外分光光度法检测RNA浓度分别为1.41 μg/uL、1.35 μg/uL；并用变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA分子完整性。

（2）逆转录PCR合成cDNA。在RNA酶灭活的0.2 mL PCR管中配置20 μL如下反应体系：5× PrimeScripBuffer 2.0 μL，PrimeScripRT Enzyme MixI（10 mM）0.5 μL，Oligo dT Primer，Random primer各0.5 μL，总RNA≤1.0 μg，最后加入RNase free H2O至20 μL；37℃15 min--85℃5 s --4℃维持，得到RT反应液，即cDNA模版。

（3）Real-Time PCR。配置20 μL如下反应体系：SYBRPremix Ex TaqTMI（I2×）10.0 μL，Forward Prime（r10 μM）0.8 μL，Reverse Prime（r10 μM）0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，RT反应液≤2.0 μL，最后加RNase free H2O至20 μL，反应条件：95℃30 s--95℃5 s，60℃31 s重复40个循环--72℃45 s。

（4）结果计算：每个样品进行3次重复试验。记录各孔的Ct值。每个样品的Ct值以3个复孔的平均Ct值±标准差（±s）表示。采用经典的2-ΔΔCt相对定量法计算：△Ct（目的基因）=目的基因Ct值-内参对照基因的Ct值，△△Ct=△Ct（目的基因）-△Ct（标准值），目的基因的相对总量为2-ΔΔCt。Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，Ct值与miRNA的表达水平呈负相关，即CT值越高，说明miRNA表达水平越低。

2．Western blot检测COX-2的蛋白表达

（1）实验分组：细胞均接种于六孔板，3×105/孔。①SW1116细胞，分别转染阴性对照质粒和PPARα干扰质粒，转染72 h后检测PPARα干扰质粒对PPARα蛋白水平的抑制情况；②人结肠癌羟基喜树碱多药耐药SW1116/HCPT细胞株，每孔加入培养液2 mL，12 h后予以PPARα激动剂WY-14643进行干预，终浓度分别为50 μM、100 μM、250 μM，阴性对照为同等浓度的DMSO加培养液，干预48 h后，抽提蛋白；③SW1116细胞和人结肠癌羟基喜树碱多药耐药SW1116/HCPT细胞，分别收集细胞总蛋白。

（2）实验方法：用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液细胞，抽提细胞总蛋白，Bradford法进行蛋白定量，配置10%分离胶，4%的基层胶，上样，每孔加入50 μg蛋白，进行SDS-PAGE电泳，PVDF转膜封闭，加入一抗，二抗孵育，洗膜，化学发光；同上操作进行内参照GAPDH检测，ImageJ 1.5软件分析条带灰度值。

3．ELISA检测细胞培养上清中PGE2含量

（1）实验分组：同western blot，细胞接种于六孔板，3×105/孔，每孔最终培养液体积为1.5 mL。①转染后24 h，48 h后收集细胞培养上清；②WY-14643进行不同浓度干预，作用24 h后收集细胞培养上清；③接种48 h后收集细胞培养上清。

（2）制备PGE2不同浓度标准品，工作液及待测样品：①按浓度梯度稀释法，配置浓度分别为2 500 pg/mL、1 000 pg/mL、500 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/ mL的PGE2工作液。配置好的PGE2工作液在60 min内进行检测。②取20 mL洗脱液，加入双蒸水，1：25倍稀释后放于4℃备用。③将过氧化氢和四甲基联苯胺等体积混匀，配置成底物反应溶液，15 min内避光备用。

（3）收集细胞培养上清：取0.5 mL培养上清，加入0.5 mL 800 mol/L乙醇及10 μL冰醋酸轻微混合，室温静置5 min，以4 000 g离心10 min，清除培养液中残留的颗粒和细胞，取上清放入1.5 mL无菌EP管中，立即检测。

（4）ELISA操作方法：①将RD5-39稀释液200 μL加入NSB（非特异性结合孔，只加样品，不加抗体）。RD5-39稀释液150 μL加入B0孔。将待检测样品、标准品工作液加入96孔酶标板中，每孔150 μL，每个待测样品和标准品设三个复孔；②每孔依次加入50 μL PGE2的一抗（NSB除外），50 μL PGE2Conjugate，粘附贴条覆盖，室温下避光孵育2 h；③小心除去孔内的混合液，每孔加入400 μL稀释后洗脱液，停留数分钟后，将96孔板倒置于干净的纸巾上，多次扣板，到纸巾上无水渍出现为止；共洗4次；④每孔加入200 μL底物反应溶液，室温避光孵育20 min后，每孔加入50 μL反应终止液，微震96孔板，充分混匀；⑤放于酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔的吸光值，校正波长为570 nm；⑥根据PGE2标准品所测出的OD值，制作PGE2含量标准曲线，根据计算公式推算待检样品中PGE2的含量。

4．流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期SW1116/HCPT细胞，3×105/孔接种于六孔板，24 h后给予不同浓度的PGE2进行干预，50 μg/mL的PGE2储存液，分别取5 μL、0.5 μL加入2 mL RPMI-1640无血清培养液中，使PGE2的最终浓度分别为10-7mol/L，10-8mol/L。干预48 h后上流式细胞仪检测。每个样品设3个复孔，实验重复3次。

三、统计学处理

结果

一、COX-2在多药耐药SW1116/HCPT细胞中的mRNA水平和蛋白表达水平明显下降，且伴随其活性降低

Realtime PCR重复3次检测COX-2在SW1116细胞，多药耐药SW1116/HCPT细胞中的相对表达，相对比为5.65：1；12.895：1；8.195：1；平均8.9133±3.6755；P＜0.05，差异显著。同SW1116细胞相比，在耐药细胞中，COX-2的mRNA水平和蛋白表达水平，均降低；即使增加上样量SW1116/ HCPT中COX-2蛋白表达仍很低（如图1）；同时用ELISA检测两种细胞在同样的培养条件下，细胞培养上清中PGE2的微量变化，在SW1116/HCPT耐药细胞中，PGE2含量明显降低（［2.5892±0.1510）ng/ mL vs（0.5137±0.0845）ng/mL，P=0.0034］；间接反映了COX-2在两种细胞中的活性差别（如图2）。

图1　COX-2的mRNA和蛋白表达差异

图2　SW1116、SW1116/HCPT细胞培养上清中PGE2含量

二、PPARα激动剂WY-14643促进COX-2蛋白表达，提高COX-2活性

为了进一步研究PPARα对COX-2调节作用，我们选择COX-2表达相对比较低SW1116/HCPT细胞，给予PPARα激动剂WY-14643进行干预，用DMSO稀释至终浓度分别为50 μM、100 μM、250 μM，对照组均加同等浓度的DMSO（设为0 μM）；见图3F中，WY-14643干预后，同对照组相比，COX-2蛋白在100 μM、250 μM表达明显升高，在50 μM浓度无明显变化；100 μM和250 μM浓度相比，蛋白表达水平无明显变化。见图3A中，50 μM组，PGE2含量为（0.2675±0.03658）ng/mL vs（0.2443±0.01228）ng/mL（对照0 μM）；P值为0.2325，无显著差异；图3B中，100 μM：（0.5483± 0.0614）ng/mL，P值分别为0.0083，差异显著；图3C中，250 μM：（0.7851±0.0203）ng/mL，P值为0.000，差异显著。此外，我们还进行了不同浓度之间的组间比较：图3D中，50 μM组同100 μM组相比，P值为0.0025；图3E中，250 μM浓度组同100 μM浓度组相比，P值为0.0098，说明激动剂WY-14643在增加COX-2蛋白表达的同时，也提高了COX-2酶的活性，进而促进PGE2的生成。随着干预浓度的增加，PGE2的合成也逐渐增多，存在剂量依赖相关性。

三、PPARα表达下调抑制COX-2蛋白表达，减少PGE2的合成

在之前的研究中建立了PPARa干扰质粒［4］，载体为p-RNAT-U6.1/neo，shRNA 5′CGATCAAGTGACATTGCTAAA 3′。如图4A所示，PPARa干扰质粒下调PPARα蛋白表达，COX-2的蛋白表达也有所下降；图4B中，同SW1116的转染试剂阴性对照组相比，PPARα表达下调后PGE2的含量均明显下降。24 h组PGE2含量由对照组的（2.9405± 0.7167）ng/mL降低为（0.2818±0.0330）ng/mL；48 h组，由对照组的（2.2300±0.2468）ng/mL下降至（0.5533±0.0100）ng/mL，统计P值分别为0.0345和0.0107。

图3　WY-14643对COX-2蛋白表达和酶活性影响的测定

图4　PPARα表达下调对COX-2蛋白表达和活性的影响

四、PGE2促进SW1116/HCPT细胞的增殖

细胞周期的观察指标有细胞增殖指数（Proliferation index，PI）和S期细胞分数（S-phase cell fraction，SPF）。PI反映处于增殖期状态的细胞所占总细胞的百分数。增殖指数PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S +G2/M）×100%。如图5所示，给予不同浓度PGE2干预后，G1比例逐渐降低，而S比例逐渐升高，PI由对照组的（32.2±2.13）%，上升到（42.2±3.14）%、（52.1±2.43）%，实验重复3次后，通过对细胞周期PI的多样本均数方差分析，P值为0.0123，差异有统计学意义。结果提示PGE2可能通过对细胞周期的改变来促进细胞增殖。在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药SW1116/HCPT细胞株中，由于COX-2表达水平的下调，我们推测在该细胞中，PGE2的合成也应该是减少的，并且通过我们对SW1116细胞和SW1116/HCPT细胞培养上清的ELISA检测，结果显示PGE2的浓度在后者也是非常低的。

图5　PGE2对细胞周期的影响

讨论

过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）参与调控脂质代谢、能量平衡和炎症反应的基因表达。研究已表明，PPARα是肝脏线粒体、过氧化物酶体β-氧化和微粒体ω氧化的主要调节器［5］。在人类，PPARα主要表达于心、肝、肾近曲小管、骨骼肌和棕色脂肪等代谢活跃组织；另外，在单核细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞有较低水平表达［6］。

环氧化酶（COX）是前列腺素合成过程中的重要限速酶。COX-2是诱导型同工酶，静息时不表达，在各种细胞因子、癌基因诱导下高表达［7］，产生大量COX-2，促进组织大量合成前列腺素（prostaglandins，PGs），尤其是前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）介导炎症、疼痛、发热等病理生理过程，通过促进细胞增殖、血管形成、抑制细胞凋亡及免疫功能等机制，参与肿瘤发生和发展。在胃癌［8］、肺癌［9］、前列腺癌［10］、胰腺癌［11］等肿瘤组织中高表达。近年来研究显示COX-2不仅与结、直肠癌的发生密切相关，促进肿瘤的转移与侵袭［12-13］，COX-2作为一个促癌基因已受到广泛研究和关注。COX-2还受PI3-K/mTOR等信号通路的调节，在脂质代谢方面发挥调节作用［14］。

人结肠癌羟基喜树碱SW1116/HCPT耐药细胞株，是研究结肠癌多药耐药的理想模型［4，15］。运用基因芯片技术对比研究了SW1116/HCPT耐药细胞株与非耐药SW1116细胞株在mRNA水平的差异，发现SW1116/HCPT细胞中存在多种耐药相关基因表达改变，其中PPARα下调倍数高达105倍［3］。研究表明PPARα表达缺失导致对HCPT耐药的抗肿瘤效应，miR-506过表达可以通过抑制PPARα的表达，促进SW1116/HCPT耐药细胞株对HCPT的耐药［4］。我们的研究发现，同SW1116细胞株相比，SW1116/HCPT耐药细胞株中COX-2的mRNA水平下降了8倍，蛋白水平也明显下降，并且COX-2的蛋白表达随着PPARα表达下调而下降。为了进一步研究PPARα对COX-2的调节作用，我们采用更敏感的ELISA检测法，检测细胞培养上清中PGE2的含量，来间接反应COX-2的活性。结果发现PPARα激动剂WY-14643在促进COX-2蛋白表达的同时也提高了COX-2的酶活性表达，表现为PGE2含量的剂量依赖性升高；我们还利用RNA干扰技术，下调PPARα的表达后，再次检测PGE2的含量，结果发现，同SW1116转染阴性对照质粒组相比，转染PPARα干扰质粒的SW1116细胞，培养上清中PGE2的含量由2.94 ng/mL降低到0.28 ng/ mL；从这两方面来看，PPARα对COX-2可能是存在着正向调节的关系，即PPARα可以促进COX-2的表达，PPARα的下调同样也抑制了COX-2的表达。因此我们推测在结肠癌多药耐药SW1116/ HCPT耐药细胞中，存在PPARα/COX-2/PGE2的调节机制，COX-2很可能是PPARα的靶基因。

有关COX-2的研究已经发现，阿司匹林及其他非甾体类抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）能降低大肠癌的发病率及死亡率并且与COX-2的活性受到抑制有关［16］。而COX-2受到抑制后，其产物PGE2的合成必将减少。目前的研究发现PGE2可以通过抑制TNF-α、IFN、IL-1等促进肿瘤生长，诱导血管生成，并且可以与细胞膜受体结合或者直接进入细胞核，与细胞核受体如PPARδ结合，诱导K-ras、H-ras、Bcl-2等促癌基因的表达［17］。本研究的结果也证明，PGE2可以促进结肠癌细胞的增殖，因此COX-2的选择性抑制剂对结肠癌细胞的生长和侵袭有一定的抑制作用，COX-2选择性抑制剂具有应用于临床治疗结肠癌的潜在价值。已有研究表明，COX-2抑制剂双氯芬酸，可以抑制肿瘤中PI3-K，AKT的表达，下调抗凋亡蛋白BcL-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax、caspase-3 and cas－pase-9的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡［18］。

在我们的人结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞株SW1116/HCPT细胞中，PPARα的表达明显低于亲代SW1116细胞，如果从PPARα对COX-2正向调控来说，COX-2表达的下调似乎可以用PPARα表达的下调来解释。国外也有相关的类似研究［19］发现过氧化物酶体（PP）可以促进COX-2的表达，这与我们的实验发现基本上是一致的。此外，国外亦有文献报道脱氧胆酸盐可以通过ERK1/2-P38-MAPKAP-1信号通路，诱导COX-2的表达［20］。有研究表明，PPARα激动剂非诺贝特，可以通过抑制氧化应激、p38MAPK和JNK的磷酸化，减少自发性高血压大鼠的肾脏损害［21］。PPARα激动剂还可以通过抑制VEGF诱导的AKT的磷酸化，发挥抑制内皮细胞迁移的能力［22］。亦有研究表明，PPARα激动剂WY-14643可以促进ERK、P38的磷酸化，而ERK信号通路抑制剂PD98059和U0126则能完全抑制WY-14643诱导的纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）的释放［23］。根据以上的理论，WY-14643诱导COX-2表达增加的机制则可能是通过ERK1/2-P38-MAPK-AP-1-COX-2信号通路来实现的［20］。

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（本文编辑：郭彦东）

Role of PPARα/COX-2/PGE2pathway in human drug resistant colon cancer cell line

NIE Fang，ZHAO Xian-yuan，YU Yue-tian，YIN Rong，LI Yu-jie，CAO Jian-guo，GAO Yuan.Department of Intensive Care Medicine，Ren Ji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University.Cao Jian-guo:145 Shandong Middle Rd.Shanghai 200001.E-mail:doctorcjg@hotmail.com.Gao Yuan:1630 Dongfang Rd.Shanghai，China.E-mail:gaoyuanzhuren@126.com.

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.06.006

200001上海交通大学医学院附属仁济医院重症医学科

曹建国，E-mail：doctorcjg@hotmail.com；皋源，E-mail：gaoyuanzhuren@126.com

上海高校青年教师培养资助计划（shjdy043）

2015-07-23）