北京地区野生柴胡种质资源的ISSR研究△

赵香妍，刘长利，薛文峰，张夏楠，罗容

(首都医科大学 中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069)

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北京地区野生柴胡种质资源的ISSR研究△

赵香妍，刘长利*，薛文峰，张夏楠，罗容

(首都医科大学 中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069)

目的：通过ISSR分子标记技术考察北京地区野生柴胡不同种质资源之间的亲缘关系。方法：从43条引物中筛选出8条合适的引物，对北京地区不同产地采集的15份野生柴胡种质资源进行ISSR分析，构建聚类系统树状图。结果：8条引物共扩增出130条条带，其中多态性条带114条，占87.7%，聚类分析显示北京地区野生柴胡遗传多样性较高，并存在明显的种内遗传变异。结论：北京地区野生柴胡呈现一定的地域性分布趋势，应加以保护，初步认为百花山山腰及山脚柴胡值得推广种植，研究为北京地区柴胡种质亲缘关系研究及栽培品种的选育奠定了基础。

柴胡；ISSR；北京地区；种质资源；亲缘关系

柴胡(Bupleuri Radix)是被中国药典所收录的传统常用大宗中药材之一，具有疏散退热，疏肝解郁，升举阳气等功效。药典规定柴胡为伞形科柴胡属植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狭叶柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根[1]。但柴胡属作为伞形科最大的属，其品种繁多，文献记载表明[2-4]市场流通的商品柴胡竟达12种之多，依次为北柴胡、狭叶柴胡、膜缘柴胡、锥叶柴胡、小叶黑柴胡、黑柴胡、雾灵柴胡、银州柴胡、秦岭柴胡、兴安柴胡等，可见各地药用柴胡的品种非常混乱，且野生柴胡资源正在减少，市场需求又在不断扩大，因此，迫切需要开展野生道地柴胡的种质研究及良种选育工作，运用分子技术研究种质之间的遗传多样性及亲缘关系，有助于优良种质的筛选及培育。

ISSR(简单序列重复区间扩增多态性，Inter Simple Sequence Repeat)具有快速、高效、高遗传多样性、高重复性、高稳定性等特点，其结合了RAPD(随机扩增多态性DNA标记，Random Amplified Polymorphic DNA)及SSR(微卫星标记，Simple Sequence Repeat)分子标记的优点，是近些年分子生物学的研究热点。Zhang L等[5]就利用ISSR分子标记技术对87个油桐树样本进行了遗传关系研究，结果显示样本呈明显的地理分化。Medhi K等[6]应用RAPD及ISSR两种分子标记技术研究了三种花椒属植物的遗传多样性，发现ISSR具有较高的多态性条带比例及较多的扩增条带数。Zhan Q Q等[7]利用ISSR和SSR分子标记构建北柴胡遗传图谱，构建了包含13个连锁群、80个位点的首张北柴胡遗传图谱，为北柴胡性状基因定位及优种选育奠定了基础。

目前，湖北保康、陕西、山西等地柴胡种质ISSR亲缘关系研究均有报道，但迄今未见北京地区柴胡种质资源ISSR研究的报道，且历史上北京地区燕山、太行山一带是道地药材“北柴胡”的主要产区之一，经本草考据和产地调查，其原植物来源、外观性状和内在质量均优于其它[8]，因此，北京地区柴胡优良种质筛选与研究显得尤为重要。实验以北京产道地柴胡为材料，通过ISSR分子标记技术对比考察柴胡种内及种间的亲缘关系，为北京地区柴胡优良种质筛选及种苗繁育奠定理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Veriti PCR仪(美国ABI)，DYY-6D电泳系统(北京市六一仪器厂)，离心机(美国，scilogex)，紫外凝胶成像分析仪(法国，VILBER LOURMAT)，MM400混合型球磨仪(德国，Retsch)，微量移液器(德国，BRAND)。

1.2 试剂

DNA提取所用试剂购自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶(Takara)，100 bp DNA Ladder(NEB)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 实验材料

实验所用柴胡样品共计15份(表1)，所有样品均于2014年6～9月采收于北京房山、延庆、门头沟等京郊山区。样品由北京中医药大学刘春生教授和首都医科大学刘长利副教授鉴定。各产地样品分别取其幼嫩无虫害的叶片，-80 ℃保存备用。

表1 实验材料及来源

2 试验方法

2.1 基因组DNA提取

取植物新鲜叶片约30 mg，液氮研磨成粉末，利用植物基因组提取试剂盒提取样本的总DNA。提取的DNA于1%琼脂糖凝胶上电泳检测10 min，以2000 bp DNA Marker 为分子标记，在凝胶扫描仪下观察并拍照。

2.2 ISSR-PCR

实验中ISSR-PCR 反应体系为：25 μL反应体系：含有10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)2.5 μL，dNTP mix(2.5 mmol·L-1)3.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，引物(10 pmol·μL-1)1.5 μL，DNA模板2.0 μL。扩增程序为：预变性94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃(因引物不同而异[9])45 s，72 ℃ 2 min，45个循环；最后72 ℃延伸7 min。以ddH2O为阴性对照。PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳分离检测(电压83 V，120 min)在凝胶扫描仪下观察并拍照(见图1)。

2.3 数据分析

对产生了多态性扩增的电泳结果统计各样品的电泳条带，按相同迁移位置上有扩增条带(不论强弱)计为1，无带计为 0，得到全部样品的ISSR图谱的0/1数据矩阵，用NTSYS2.10软件计算个体间的相似系数，进行UPGMA聚类分析，构建聚类系统树状图。

M为100 bp DNA ladder，1～15为材料编号同表1，0为阴性对照图1 引物808 ISSR扩增结果

3 结果

3.1 引物筛选

利用4个样本对43条加拿大British Columbia大学提供的ISSR引物进行筛选，共初步筛选出15条可扩增出3条以上电泳条带的引物作为实验有效引物，再利用全部样本进行复筛，最终，确定8条有效引物(见表2)。

表2 有效引物及其扩增结果

3.2 野生柴胡ISSR遗传多样性

从初筛的15条引物中筛选出8条多态性好、条带清晰的引物，用于15个实验样本的PCR扩增，大部分扩增片段大小在100～1500 bp。表2表明，8条引物共扩增出130条条带，其中多态性位点114个，每个引物扩增位点为14～20个，平均16.25个，其中多态性位点8～18个，平均14.25个，多态性比率为87.7%。这说明供试样本存在较大的遗传变异。

3.3 遗传相似系数

遗传相似系数是评价物种及居群间亲缘关系的重要指标，其值越大，说明亲缘关系越近，反之，则越小。15份北京野生柴胡的样本之间相似系数在0.571～0.813之间(见表3)，其中，来自房山区将军坨的4号北柴胡样本与延庆松山自然保护区的10号北柴胡样本亲缘关系最近，相似系数为0.813。而北京市房山区百草畔山顶草甸的3号雾灵柴胡样品则与房山区蒲洼乡富合村的5号北柴胡样本亲缘关系最远，遗传相似系数为0.571。说明同一物种生活在相近环境中，亲缘关系较近，不同物种生活在不同生态环境中，亲缘关系较远。且15份样本均采自北京各郊区，地理位置较近，所以样本亲缘关系大都较近，而由于品种、生活环境或基因交流等原因致使一些样本亲缘关系较远。

表3 ISSR标记15份样本之间的相似系数和遗传距离

注：下三角为相似系数，上三角为遗传距离。

3.4 北京地区野生柴胡聚类分析

利用ISSR标记数据计算15份野生柴胡间的遗传相似系数，并采用UPGMA法构建了北京地区野生柴胡的遗传关系聚类图(图2)，显示实验样本可分为两大组，第一组共14份样品，包括除5号样品的所有样品，并分为二个亚类，第一亚类包括1号来自房山区六合，4号来自房山将军坨，10号、11号来自延庆松山，12号来自平谷区镇罗营镇，6号、8号、7号来自门头沟区百花山，9号来自海淀区西山森林公园，3号来自房山百草畔。第二亚类包括来自房山区十渡孤山寨的2号样品，来自平谷区大华山镇与王辛庄镇的13、14号样品，以及来自密云雾灵山的15号样本。而第二组则只有来自房山区蒲洼乡富合村的5号样本。

图2 15份北京野生柴胡聚类图

4 讨论

葛亚莹等[10]利用ISSR分子标记技术对41个丽穗凤梨品种进行遗传多样性研究，12条引物共扩增出132个位点，其中多态性位点125个，多态位点百分率达94.70%，表明ISSR标记具有较高的多态性检测水平。刘君等[11]则对9种狗牙根进行鉴定分析，结果显示ISSR可有效揭示9种狗牙根的亲缘关系并可用于构建指纹图谱。Feicui Zhao等[12]利用RAPD和ISSR技术研究乌头属4种植物的遗传多样性，发现两种方法均适用于乌头属植物的分析，但其中ISSR更具有较高的多态性。Jun Liu等[13]则利用ISSR及SRAP(相关序列扩增多态性，Sequence-Related Amplified Polymorphism)两种方法分析89份香菇植株的遗传多样性，结果发现这2种标记都能揭示材料间较高的遗传多样性，而且ISSR标记的多态性又高于SRAP标记。研究表明ISSR是一种有效的揭示品种间遗传多样性的实验技术，实验中利用8条引物，扩增出130条条带，其中多态性位点114个，每个引物平均扩增位点16.25个，多态性比率为87.7%，表明北京地区柴胡种质资源存在较大的遗传变异，实验研究结果为北京地区野生柴胡种质亲缘关系研究奠定了基础。

Xu L等[14]利用ISSR和SP-SRAP(单引物相关序列扩增多态性，Single Primer-Sequence Related Amplification Polymorphism)研究100份黑粉菌的亲缘关系，发现生态环境的特异性质在样品分化过程中起到了重要的作用。Yu J等[15]研究15个居群的长芒草的遗传多样性，发现其与地理距离有很大关系，并认为ISSR分子标记技术可有效可靠地评价长芒草的遗传多样性。卢萍等[16]则利用ISSR技术研究了6个种群的小花棘豆的遗传多样性，聚类结果表明，生态地理条件相近的种群会优先聚集。遗传聚类结果显示，部分结果与上述研究结果相似，6号、7号、8号均来源于门头沟百花山，9号采自海淀区西山森林公园，其生长环境与百花山山脚环境相类似，所以显示出较近的亲缘关系，13、14、15号样品均来源于北京平谷区、密云区，也具有较高的相似性，表明生态环境相近的聚为一类。

房山百草畔的3号雾灵柴胡样本与延庆松山的11号北柴胡样本聚在一起，其原因可能由于柴胡雌雄蕊异熟的特性导致其异交授粉为主的繁殖方式，一定程度上促进了居群间基因交流，进而出现基因渐渗现象，使得柴胡属植物的鉴定存在困难，以此，采用多种遗传分子标记方法与传统性状鉴定相结合的方法确定植物基源更为可靠。此外，来源于房山区蒲洼乡富合村的5号样本则可能是采集地地势相对较高，且地处偏僻的山区，基因交流相对较少，所以自成一支。

由于经济利益的驱使，人们对于野生柴胡资源的乱采滥挖现象日益严重，从而使得野生柴胡资源遭到严重破坏，药用资源得不到保障。另外，各地药用柴胡来源的复杂性造成了柴胡质量的不稳定性，以至于临床疗效受到严重影响。基于以上问题，开展柴胡药材的质量研究及人工栽培优良种质筛选尤为重要，而ISSR分子标记技术则能很好的揭示品种间的亲缘关系，并为栽培品种的选育奠定基础。贾金萍等[17]通过对北柴胡样本的皂苷含量、指纹图谱及AFLP(扩增片段长度多态性，Amplified Fragment Length Polymorphism)分子标记研究，认为柴胡的化学表型差异与其遗传差异具有一定的相关性，且AFLP分子标记法可有效区分不同的柴胡种群。而也有学者[18]表示皂苷含量较高且遗传多样性丰富的种质资源更具有推广的价值。实验结果显示，皂苷含量较高的西山森林公园的9号样本(课题组已测定)与门头沟百花山的7号、8号样本亲缘关系较近(见表3)，初步认为百花山山脚与山腰的柴胡种质遗传多样性较好，值得推广种植。此外，柴胡属植物由于基因渐渗出现的资源混乱的复杂问题，则可利用ISSR等分子标记技术与标准药材进行亲缘关系研究，并与形态鉴定结合的方式进行鉴定，使得结果更加可靠，进而提高用药效果。

5 结论

利用ISSR分子标记技术对北京地区野生柴胡的亲缘关系研究中，15份样本扩增出130条条带，其中多态性位点114个，每个引物平均扩增位点16.25个，相似系数在0.571～0.813之间，表明北京地区野生柴胡具有较高的遗传多样性，并同时存在一定的种内遗传变异。而利用UPGMA聚类分析，则将15份材料进行分类，聚类结果呈现出一定的地域性分布趋势。综上，北京地区野生柴胡应加以保护，初步认为百花山山腰及山脚柴胡值得推广种植，研究为今后开展北京地区柴胡种质亲缘性研究及栽培品种的选育奠定了基础。

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ISSRResearchonGermplasmofBupleurumchinenseDC.inBeijing

ZHAOXiangyan，LIUChangli*,XUEWenfeng，ZHANGXianan,LUORong

(SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch，Beijing100069，China)

Objective：To assess population genetic diversity of different kinds of individuals ofBupleurumchinensein Beijing area by inter simple sequence repeat (ISSR) technique.Methods：Eight appropriate ones were selected from a total of forty-three primers for ISSR PCR amplification to analyse theBupleurumin Beijing area and draw dendrograms by using genetic distance UPGMA method.Results：A total of 130 bands and 114 polymorphic bands were amplified by 8 primers，the polymorphic loci accounted for 87.7%.The cluster analysis showed that genetic diversity was high inBupleurum， the intraspecific genetic variation was obvious.Conclusion：The distribution ofBupleurumgermplasm in Beijing exhibited a certain regional characteristics.It is imperative to strengthen the protection ofBupleurumwild resources.The plants in the foot and hillside of Baihuashan is good for cultivating.This study laid a foundation for the research of relationship betweenBupleurumand the breeding of cultivars.

Bupleurum；ISSR；Beijing area；germplasm；genetic relationship

2015-07-01)

北京市自然科学基金资助项目(6142002)；首都中医药研究专项(14ZY04)

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刘长利，副教授，研究方向：中药材规范化生产及其药材质量调控研究；Tel：(010)83911633，E-mail：lcl74@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.004