芪精多糖片治疗化疗骨髓抑制的药效评价及调控Notch表达的研究△

王立芳，徐振晔，司海龙，王中奇，邓海滨，苏婉

(上海中医药大学 附属龙华医院 肿瘤二科，上海 200032)

·基础研究·

芪精多糖片治疗化疗骨髓抑制的药效评价及调控Notch表达的研究△

王立芳，徐振晔*，司海龙，王中奇，邓海滨，苏婉

(上海中医药大学 附属龙华医院 肿瘤二科，上海 200032)

目的：进一步评价芪精多糖片治疗骨髓抑制小鼠的疗效，探讨其作用机制。方法：采用小鼠腹腔注射环磷酰胺造成化疗骨髓抑制模型，用芪精多糖片干预治疗，常规计数白细胞、红细胞、血小板、骨髓有核细胞数，流式细胞仪检测Sca-1+CD34+细胞以比较骨髓造血干细胞比例，FQ-PCR法检测Notch1、Notch2 mRNA表达。结果：治疗组白细胞、骨髓有核细胞、造血干细胞数、Notch1表达、Notch2表达均高于模型对照组，血小板、红细胞治疗组与模型组未发现差异。结论：芪精多糖片具有良好的升高化疗骨髓抑制小鼠白细胞的作用，其作用机理与调控Notch1、Notch2 mRNA表达、促进骨髓造血干细胞增殖有关。

芪精多糖；骨髓抑制；造血干细胞

芪精多糖片来源于上海中医药大学附属龙华医院徐振晔教授的经验方药双黄升白方，属于中药成分组合制剂，目前剂型为片剂，主要用于治疗肿瘤化疗导致的骨髓抑制(主要表现为白细胞降低)，前期研究已明确该药具有良好的改善化疗骨髓抑制期骨髓造血功能的作用，升高白细胞疗效较好，且已确定最佳服用及有效剂量[1-5]。本研究在前期基础上对其治疗化疗骨髓抑制的药理药效进行了进一步研究。

1 材料

1.1 动物

SPF级近交系昆明小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，合格证号：SCXK(沪)2012-0002，雄性，20 g左右。饲养于上海中医药大学附属龙华医院SPF级饲养室，动物房设施许可证号SYXK(沪)2010-0095。

1.2 主要药物与试剂

芪精多糖片(上海静安制药厂，批号：141104-1)；注射用环磷酰胺(CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：13052425)；cDNA合成试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(bioline公司)；CD34抗体、Sca-1抗体(biolegend公司)；引物探针(上海捷瑞生物工程公司)，Notch1引物序列：Sense：5′actgtgacagccagtgcaac 3′，Antisense：5′gccatcactgaagtggtcct 3′；Notch2引物序列Sense：5′ cagcactgtgacagccctta 3′，Antisense：5′aggtgctcccttcaaaacct 3′。内参GAPDH引物序列Sense：5′aactttggcattgtggaagg3′，Antisense：5′ggatgcagggatgatg-ttct3′。

2 方法

2.1 模型制备及分组

24只昆明小鼠随机分为正常组、模型组、治疗组，每组8只。正常组腹腔注射0.9%氯化钠溶液2 mL，连续3 d；灌服0.9%氯化钠溶液0.4 mL·d-1，连续6 d。模型组腹腔注射CTX用法同治疗组；灌服0.9%氯化钠溶液0.4 mL·d-1，连续6 d。治疗组腹腔注射CTX 2 mL·d-1，相当于100 mg·kg-1·d-1，连续3 d；灌服芪精多糖溶液(药物剂量采用前期研究确定最佳服药剂量[5])0.4 mL·d-1，相当于芪精多糖0.66 g·kg-1·d-1(黄芪多糖0.45 g，黄精多糖0.21 g)，连续6 d。

2.2 观察指标及方法

各组分别于最后一天用药后2 h摘眼球采血，颈椎脱臼处死，无菌无RNA酶条件下迅速剥取双侧股骨，以医用剪刀剪开小鼠股骨两端，露出骨髓腔，备用。观测以下指标：(1)血常规：KT6180全自动血细胞分析仪观察外周血白细胞、红细胞、血小板的数量；(2)骨髓有核细胞数：取左侧股骨，以1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)液反复冲洗，直至骨髓腔发白，将洗脱的骨髓细胞置于1.5 mL离心管，取0.1 mL用细胞计数板计数，显微镜下计数有细胞核的细胞数量(不包括无细胞核的成熟红细胞)，计数所得的10倍即为单侧股骨总有核细胞数。(3)骨髓造血干细胞数：左侧骨髓迅速进行有核细胞计数后，加入红细胞裂解液，去除红细胞，PBS洗后重新悬浮，以Sca-1+CD34+为标记检测小鼠骨髓造血干细胞，吸取100 μL细胞悬液(细胞浓度≥1×106个· mL-1)，分别加入10 μL PE标记的大鼠抗小鼠Sca-1抗体和FITC标记的大鼠抗小鼠CD34抗体，同时以不加抗体的细胞悬液作阴性对照，室温避光孵育20 min，重新悬浮，上流式细胞仪检测。(4)Notch1、Notch2 mRNA表达：无菌无RNA条件下迅速取右侧股骨，PBS反复冲洗出骨髓，收集骨髓细胞，常规进行总mRNA的抽提，FQ-PCR法检测Notch1与Notch2 mRNA表达，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，内参及Notch1、Notch2溶解曲线见图1-3。

图1 GAPDH熔解曲线

图2 Notch 1溶解曲线

图3 Notch 2溶解曲线

详细方法如下：将骨髓细胞置于研磨器(1.5 mL EP管)中，加入1 mL预冷的Trizol研磨，常规进行mRNA抽提；cDNA第一链合成(反应条件：45 ℃ 30 min逆转录；85 ℃，5 min，灭活MMLV)，-20 ℃冰箱，保存，待用；real-timePCR检测，PCR扩增检测条件见表1。

表1 PCR扩增检测条件

数据采用仪器自带软件ABI Prism 7500 SDS Software分析。mRNA相对表达量=2-Δct×100%，Δct=目标基因CT值-内参(GAPDH)CT值。

2.3 统计方法

采用SPSS20.0进行统计，进行方差齐性检验，采用单因素方差分析，以P<0.05为有统计学差异。

3 结果

3.1 血常规分析

模型组应用CTX造模后白细胞较正常组明显下降，而治疗组虽然较正常组白细胞降低，但高于模型组(P<0.05)，因此可以推论芪精多糖片具有升高骨髓抑制小鼠白细胞的作用。模型组血小板较正常组降低(P<0.05)，但与治疗组比较无统计学差异，有待今后增大样本量进一步观察。模型组红细胞较正常组与治疗组低，但无统计学差异，考虑与红细胞寿命较长、本研究观察期较短有关，有待今后延长观察期以进一步明确芪精多糖片是否对骨髓红系造血功能有促进作用。见表2。

表2 各组白细胞、红细胞、血小板计数比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与正常组比较，△P<0.05；下同。

3.2 骨髓有核细胞数

骨髓有核细胞数是反应骨髓造血功能的主要指标之一。模型组骨髓有核细胞数明显低于正常组(P<0.05)，而治疗组骨髓有核细胞数未见明显降低(P>0.05)，考虑应用CTX后骨髓造血功能抑制，骨髓有核细胞数减少，应用芪精多糖片干预后造血功能抑制减轻、恢复加快。见表3。

表3 小鼠骨髓有核细胞数的比较

3.3 造血干细胞数量比较

CD34、Sca-1为小鼠骨髓造血干细胞标志物，模型组及治疗组Sca-1+CD34+细胞比例高于正常组(P<0.05)，考虑与第4天停用CTX后骨髓造血功能进入恢复期、造血干细胞增殖加速有关。治疗组Sca-1+CD34+细胞比例高于模型组(P<0.05)，结合骨髓有核细胞数量比较，考虑芪精多糖片具有较好的促进骨髓造血干细胞增殖的作用，见图4-6、表4。

3.4 Notch1与Notch2 mRNA表达

Notch信号能促进造血干细胞增殖，其mRNA表达高低可从一定程度上反映骨髓造血细胞增殖情况。本研究中Notch1 mRNA表达治疗组较模型组及正常组均升高(P<0.05)，模型组则较治疗组降低(P<0.05)，Notch2表达模型组与正常组无差异(P>0.05)，治疗组较模型组及正常组均明显升高(P<0.05)。考虑芪精多糖片具有促进化疗骨髓抑制小鼠骨髓中Notch1、Notch2 mRNA表达的作用。见表5。

图4 正常组造血干细胞比例图

图5 模型组造血干细胞比例图

图6 治疗组造血干细胞比例图

表4 小鼠造血干细胞(Sca-1+CD34+细胞)的比较

表5 小鼠骨髓Notch1、Notch2 mRNA相对表达量的比较

4 讨论

骨髓抑制是肿瘤化疗常见不良反应，主要表现为外周血细胞(尤其是白细胞)降低，目前治疗肿瘤化疗骨髓抑制主要采用集落刺激因子(CSF)促进骨髓造血干细胞增殖分化。然而，造血干细胞的增殖分化更多地依赖于造血微环境的调控，CSF仅是其中的一方面因素。芪精多糖是来源于上海市名中医徐振晔教授经验方药的中药组分制剂，具有良好的临床基础[2]，前期研究已发现该药物成分组合对于骨髓造血微环境具有良好的保护和促进作用。

Notch是造血系统发育过程中的一条重要信号通路，与造血干细胞增殖、分化、自我更新密切相关，存在于所有已知动物细胞中，介导细胞间的局部信号传递及相应的信号级联反应，能够扩大并固化相邻细胞之间的分子差异，最终决定细胞的命运[6]。抑制Notch信号能加速造血干细胞的分化，降低其造血重建能力[7]。本研究发现治疗组Notch1、Notch2 mRNA表达升高，说明芪精多糖能加速这种功能恢复过程，因此我们认为芪精多糖治疗骨髓抑制的机制与调控Notch表达有关。

组分中药是21世纪中药新药研究和开发的创新模式，它突破了传统中药方剂成分较为繁杂、药效和药物质量不稳定等缺陷。在传统祖国医学理论指导下，将所提取中药有效组分进行配伍和组方，所制成的复方制剂，既具有现代药理学的现代性，且又兼备中药复方配伍联合应用的传统特点，可阐明多个有效组分之间的相互作用的性质(增效、拮抗、相加)[8]。与传统中药方剂相比，组分中药具有“安全、有效、稳定、可控”的药物特征，还具有复方、配伍、多途径、多靶点、多效应整合调控作用模式等中医药特点[9]。芪精多糖目前已制成片剂，制剂工艺简捷，药品质量稳定，口感良好，本研究对其治疗化疗骨髓抑制的疗效进行了进一步评价，从调控Notch信号角度对其机制进行了探讨，为其向临床新药转化提供了理论基础，但该药对红细胞及血小板的影响尚待进一步研究，今后进一步阐述其作用机制有利于促进该制剂申报新药，为临床治疗肿瘤化疗骨髓抑制提供新的选择。

[1] 吴秋霞.黄芪黄精药对主要组分配伍配比对骨髓抑制小鼠造血系统保护作用的研究[D].上海：上海中医药大学，2011.

[2] Xu Zhenye，Zhu Yanwei，Zhou Weidong，et al.Clinical Observation on Effect of Shuanghuang SengbaiGranule on Chemotherapy Induced Myelosuppression in Tumor Patients and on Ultrastructure of Bone Marrow in Mice[J].CJIM，2001，7(4)：277-281.

[3] Xian Gu，Zhenye Xu，LingYu Zhu，et al.Dual control of Shuanghuang Shengbai Granule on CyclinD-CDK4/6 signal pathway of cell reproductive cycles in Lewis-bearing mice with cyclophosphamide-induced myelosuppression[J].Onco Targets and Therapy，2013，6：199-209.

[4] 顾贤，徐振晔，王立芳，等.双黄升白颗粒双向调控细胞周期CyclinD-CDK4/6信号途径的进一步研究[J].辽宁中医药大学学报，2011，13(12)：32-35.

[5] 高嵩.芪精多糖片治疗化疗骨髓抑制白细胞减少症的药学、药效药理研究[D].上海：上海中医药大学，2015：35-38.

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[8] 叶祖光.中药复方与组分中药[J].中国新药杂志，2011，20(16)：1487-1489.

[9] 苗明三，马霄，王灿.中药有效组分配伍研究的探讨[J].中药新药与临床药理，2009，20(5)：487-490.

EfficacyEvaluationofQiJingPolysaccharideTabletsinTreatmentofBoneMarrowInhibitionCausedbyChemotherapyandResearchinRegulationofNotchExpression

WANGLifang，XUZhenye*，SIHailong，WANGZhongqi，DENGHaibin，SUWan

(TraditionalChineseMedicineTumorResearchInstituteofShanghaiUniverstityofTCM，Shanghai200032，China)

Objective：To further evaluate the treatment efficacy of Qi Jing polysaccharide tablets on mice with bone marrow suppression and explore the mechanism.Methods：The mice bone marrow suppression model caused by intraperitoneal injection of cyclophosphamide were used in the study，Qi Jing polysaccharide tablets were given for the intervention treatment.The conventional counting white blood cells，red blood cells，platelet count，bone marrow nucleated cells were measured，the Sca-1+CD34+ positive cells of bone marrow were detected by using flow cytometry to compare the stem cells number.The Notch1 and Notch2 mRNA expression were detected by FQ-PCR method.Results：The Notch1，Notch2 mRNA expression in white blood cells，bone marrow cells and hematopoietic stem cell number in the bone marrow in the treatment group were higher than those in the control group.There was no difference between treatment group and the untreated group in platelets and red blood cells counting.Conclusion：Qi Jing polysaccharide tablets have good effect on increasing white blood cells of mice with chemotherapy caused myelosuppression，the mechanism is related to regulation of Notch1，Notch2 mRNA expression and promotion of bone marrow stem cell proliferation.

Qi Jing polysaccharide tablets；myelosuppression；hematopoietic stem cell

2015-06-03)

国家自然科学青年基金资助项目(81202670)；上海市科委自然科学基金资助项目(12ZR1431800)；上海市卫生局资助项目(2011XY006)

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徐振晔，主任医师，研究方向：中医药治疗恶性肿瘤及相关疾病；E-mail：xuzhenye1947@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.010