果胶酶解法提取陈皮中橙皮苷的工艺研究△

许玲玲，杨晓东，李群力，陈贵颖，盛柳青，陈菲，蔡芸芸

(金华职业技术学院 医学院，浙江 金华 321007)

·中药工业·

果胶酶解法提取陈皮中橙皮苷的工艺研究△

许玲玲，杨晓东*，李群力，陈贵颖，盛柳青，陈菲，蔡芸芸

(金华职业技术学院 医学院，浙江 金华 321007)

目的：研究酶解法提取陈皮中橙皮苷的工艺条件。方法：在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对提取工艺进行优化。结果：最佳工艺条件液料比为40∶1(mL·g-1)；果胶酶用量为3.2%；pH值为3.0；酶解温度为45 ℃；酶解时间为2.3 h。在此条件下，橙皮苷提取率理论值为5.45%，实测值为5.40%。结论：酶解法提取橙皮苷操作简单、提取率高，有利于企业大生产，但存在着提取时间长、溶剂用量大等缺点。

酶解法；响应面分析；陈皮；橙皮苷；提取

橙皮苷具有降低血管脆性、降血压、抗过敏、抑制肿瘤、抗氧化和清除自由基等作用[1-3]，在临床上用于心血管系统疾病的辅助治疗[4]，也可用于医药工业中制药的原料，橙皮苷还作为天然抗氧化剂用于食品和化妆品行业[5]。

从陈皮中提取橙皮苷通常采用热水提取、醇回流提取、碱提酸沉等方法[6-7]，这些方法都是采用化学溶剂浸润、溶解药材中的有效成分，虽然操作简单，但提取不完全，会造成一些橙皮苷残留在果渣里，使用的化学试剂也易造成环境污染[8]。近年来有报道[9-10]微波和超声波辅助提取橙皮苷，虽然这两种方法提取时间短，但超声法噪音很大，微波法有辐射，它们对提取设备有很高的要求，这在一定程度上限制了其在企业大生产中的应用。

为了探索一种操作简单、产率高，有利于企业大生产的橙皮苷提取新方法，我们采用酶解法破坏药材细胞壁和细胞间的果胶，使橙皮苷充分溶解出来，提高橙皮苷的提取率。先通过单因素试验考察酶解法各因素对橙皮苷提取率的影响，再采用响应面分析法对酶解工艺进行优化，得到最佳工艺。

1 材料与仪器

1.1 材料

陈皮(金华市三溪堂国药馆，四川产)；果胶酶(天津市诺奥科技发展有限公司)；橙皮苷对照品(中国食品药品鉴定研究院，批号：110721-201115)；甲醇为色谱纯；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

SP-2012UV PC紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；Waters高效液相色谱仪(2487紫外分光检测器)；1004 型电子天平(上海天平仪器厂)；HH-6数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)。

2 方法

2.1 酶解法提取陈皮中的橙皮苷

取适量陈皮粗粉置于锥形瓶中，加入蒸馏水和酶，调节pH值，置于恒温水浴箱中酶解一段时间，取出，放冷过滤，得橙皮苷提取液。

2.1.1 单因素试验考察酶解法影响因素 通过单因素试验，分别考察酶的用量、酶解时间、酶解温度、pH值、液料比等因素对橙皮苷提取率的影响，每个处理重复3次，取平均值。

2.1.2 响应面分析法优化提取工艺 在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取对橙皮苷提取率影响较大的3个因素，进行中心组合试验设计，做多组试验。然后采用Design-Expert 8.0.5.0程序，对数据处理，进行响应面分析优化，最终得到优化工艺参数。

2.2 橙皮苷含量测定方法

2.2.1 对照品溶液的配制 精确称取橙皮苷对照品10.1 mg，加入适量甲醇，超声溶解，用甲醇定容到25 mL，配制成质量浓度为0.404 mg·mL-1的橙皮苷对照品溶液。

2.2.2 陈皮样品液的制备 将酶解工艺提取所得的溶液，稀释适当倍数，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 检测波长的确定 以空白溶剂甲醇为参比溶液，通过紫外可见分光光度计对橙皮苷对照品溶液进行扫描(200～400 nm)，同时，对陈皮样品溶液进行光谱扫描。结果显示，橙皮苷对照品溶液和陈皮样品液都在285 nm处有强吸收峰，因此取285 nm为检测波长。

2.2.4 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：甲醇-2%冰醋酸溶液(34∶66)；流速：0.5 mL·min-1；检测波长：285 nm；温度为室温；进样量：20 μL；橙皮苷保留时间为5.1 min。

2.2.5 标准曲线的制备 分别精密吸取橙皮苷对照品溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，配成质量浓度分别为40.4、80.8、121.2、161.6、202 μg·mL-1的一系列对照品溶液，进行HPLC测定。在285 nm处测峰面积，以橙皮苷对照品溶液的浓度X(μg·mL-1)为横坐标，以其峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=185 220X-25 642，r=0.999，线性范围为40.4～202 μg·mL-1。橙皮苷对照品溶液的HPLC图见图1。

图1 橙皮苷对照品溶液的HPLC图

2.2.6 精密度试验 精密吸取陈皮样品溶液20 μL，进样，测定。连续重复5次，计算橙皮苷峰面积的RSD为1.15%(n=5)。表明本法精密度良好。陈皮样品溶液HPLC图见图2。

图2 陈皮样品溶液的HPLC图

2.2.7 稳定性试验 精密吸取陈皮样品溶液20 μL，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积，计算橙皮苷峰面积的RSD为2.21%(n=5)。表明制备的陈皮样品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 精密称取陈皮粗粉20 g，5份，加蒸馏水200 mL，加入0.6 g果胶酶，溶液pH值为5.0，置于45 ℃的恒温水浴箱中，酶解4 h。然后升温到100 ℃，煮沸20 min灭酶，取出，放冷过滤。滤液稀释后，进样测定，计算橙皮苷的含量，RSD为4.85%(n=5)，表明重复性较好。

2.2.9 加样回收试验 精密称取陈皮粗粉20 g，5份，置于锥形瓶中，分别精密加入一定量的橙皮苷对照品溶液，按照2.2.8项下酶解方法处理，进样测定，计算橙皮苷的回收率。测得平均回收率95.58%，RSD为4.33%(n=5)，表明该法测定橙皮苷准确度高。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果与分析

3.1.1 果胶酶用量对橙皮苷提取率的影响 称取陈皮粗粉各20.00 g，加水200 mL，即液料比10∶1(mL·g-1)，加果胶酶的用量分别为陈皮药材的0%、0.5%、0.75%、1.50%、3.00%、4.50%、6.00%，pH值为5.0，置于45 ℃的恒温水浴箱中，酶解4 h。然后升温到100 ℃，煮沸20 min灭酶，取出，放冷过滤，滤液稀释后，测定峰面积，计算含量。结果见图3。

图3 果胶酶用量对橙皮苷提取率的影响

由图可以看出，仅用水提取陈皮中的橙皮苷时，提取率很低，当加入果胶酶后，提取率明显提高。当加入果胶酶的用量是3%时，提取率最高。

3.1.2 酶解温度对橙皮苷提取率的影响 称取陈皮粗粉各20.00 g，加水使液料比为10∶1(mL·g-1)，加入果胶酶3%，pH值为5.0，分别置于40、45、50、55、60、65 ℃的恒温水浴箱中，酶解4 h。然后灭酶，过滤，测定含量。结果见图4。

图4 酶解温度对橙皮苷提取率的影响

由图可以看出，果胶酶对温度比较敏感。当酶解温度达到45 ℃，橙皮苷提取率达到最高，当温度继续升高时，橙皮苷提取率逐渐下降。这是由于温度过高会影响果胶酶的活性。因此，酶解适宜温度为45 ℃。

3.1.3 酶解时间对橙皮苷提取率的影响 称取陈皮粗粉各20.00 g，加水使液料比为10∶1(mL·g-1)，加入果胶酶3%，pH值为5.0，45 ℃条件下，分别酶解1、2、3、4、5 h。然后灭酶，过滤，测定含量。结果见图5。

图5 酶解时间对橙皮苷提取率的影响

由图可以看出，酶解时间太短，酶解不完全。当酶解时间为2 h时，橙皮苷提取率最高，延长时间，提取率下降，增加了劳动成本。因此，酶解时间2 h适宜。

3.1.4 液料比对橙皮苷提取率的影响 称取陈皮粗粉各20.00 g，加水使液料比分别为5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL·g-1)，加入果胶酶3%，pH值为5.0，置于45 ℃条件下，酶解2 h。然后灭酶，过滤，测定含量。结果见图6。

图6 液料比对橙皮苷提取率的影响

由图可以看出，水的用量对橙皮苷的提取有很大影响。加水多，增加了药材细胞内外浓度差，有利于橙皮苷的溶出，但加水量太多，不利于药液的浓缩。

3.1.5 pH值对橙皮苷提取率的影响 称取陈皮粗粉各20.00 g，加水使液料比10∶1(mL·g-1)，加入果胶酶3%，调节溶液的pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，置于45 ℃条件下，酶解2 h。然后灭酶，过滤，测定含量。结果见图7。

图7 pH值对橙皮苷提取率的影响

由图可以看出，pH值对酶的活性有较大影响，果胶酶pH 值为3.0的条件下最为适宜，橙皮苷提取率最高，当pH值继续增大，橙皮苷提取率反而下降。

3.2 响应面分析法优化提取工艺

3.2.1 响应面试验设计方案 根据响应面中心组合试验设计，研究各酶解因素对橙皮苷提取率的影响，从而得到酶解的最佳条件。在酶解温度为45 ℃，酶解液pH值为3.0的条件下，选取果胶酶用量(X1)、液料比(X2)和酶解时间(X3)这3个因素为自变量，橙皮苷的提取率为响应值。试验因素与水平的取值见表1。

表1 响应面分析试验因素和水平

通过Box-Behnken中心组合试验设计原理进行设计，响应面试验设计方案及结果见表2。试验号1、2、4、8、17为5个中心试验，用来估计试验误差，其余为析因试验。

表2 响应面试验方案设计及结果

3.2.2 模型的建立及分析 对响应值与各因素进行二次线性回归拟合，得到回归方程：Y=-0.56+1.205 25X1+0.092 275X2+1.108 5X3+0.002 5X1X2+0.017 5X1X3+0.004 75X2X3-0.209X12-0.000 79X22-0.296 5X32，r=0.987 1。式子中：Y表示橙皮苷的提取率(%)，X1表示果胶酶用量(%)，X2表示液料比(mL·g-1)，X3表示酶解时间(h)。

响应面回归模型的显著性检验和方差分析见表3，根据方差分析结果，该Quadratic回归模型的P<0.000 1，差异有统计学意义，说明与实际试验拟合好。模型的相关系数r为0.987 1，说明因变量和自变量线性关系显著。失拟项的P为0.119，P>0.05，差异无统计学意义，说明试验误差小，回归模型可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，故可以用该回归方程代替实际试验对试验结果的分析和预测。由表3可以看出，在总的作用因素中，一次项和平方项的影响较大，而交互项的影响较小。对橙皮苷的提取率影响因素顺序依次为液料比>酶解时间>酶用量。

表3 方差分析表

注：**表示差异有统计学意义(P<0.01)。

响应面图也可以直观地反映各因素对响应值的影响。见图8～10。等高线的形状可反映出交互效应的强弱。由图8可看出，酶解时间和酶用量等高线近似圆形，可知他们之间的相互作用对橙皮苷提取率的影响很小。图9、图10表明，液料比对橙皮苷的提取率影响最为突出，表现为曲线很陡峭。

图8 时间和酶用量对提取率的响应面图

图9 液料比和酶用量对提取率的响应面图

图10 液料比和时间对提取率的响应面图

3.2.3 响应面分析优化及验证性试验 采用Design-Expert 8.0.5.0程序进行响应面分析优化，理论上可得橙皮苷最佳提取工艺条件：果胶酶的用量为3.22%；液料比为40∶1(mL·g-1)；酶解时间为2.29 h，提取率为5.45%。考虑到实际操作的简便，修正最佳提取工艺条件：果胶酶的用量为3.2%；酶解时间液料比为40∶1(mL·g-1)；酶解时间为2.3 h。根据以上条件进行橙皮苷的提取，试验重复3次，橙皮苷的实际提取率为5.40%，RSD为3.57%，与理论值比较接近。表明响应面分析法所得的优化条件真实可靠，具有实用价值。

4 讨论

因柑橘果皮富含果胶，果胶存在于相邻细胞壁间的胞间层中，起着将细胞粘在一起的作用。通过果胶酶酶解，能有效地破坏细胞间的果胶，使橙皮苷充分地溶解出来。橙皮苷的含量受陈皮药材的产地和采收季节的影响，本课题研究的陈皮药材是四川产的。通过果胶酶解法，测得陈皮中橙皮苷的提取率为5.40%。据相关报道[9-10]，采用甲醇为溶剂，通过超声法提取川陈皮中橙皮苷，测得其提取率分别为4.89%、4.93%。酶解法与文献报道的超声提取法相比，提取率提高了约10%。酶解法在橙皮苷提取率方面没有大幅度提高，可能与果胶酶的质量和活度有关。

根据研究结果，果胶酶用量比较大，原因可能是购买的果胶酶活力较小且柑橘果皮果胶含量较高。我们尝试用纤维素酶来提取橙皮苷，但研究发现，其酶解效果不如果胶酶显著。

通过单因素试验和响应面分析，得到橙皮苷的最佳提取工艺条件：陈皮粗粉适量，加水使其液料比为40∶1(mL·g-1)，加入果胶酶的量为药材的3.2%，调节溶液的pH值为3.0，置于45 ℃恒温条件下酶解2.3 h。

酶解法提取橙皮苷能耗小，无需特殊设备，所用溶剂环保、经济、操作简单、生产安全性好，有利于企业大生产，但存在着溶剂用量大及提取时间长等缺点。为避免这些弊端，可考虑多次酶解法，或酶解法与其他提取方法相结合。

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OptimizationofExtractionofEsperidinfromTangerinePeelwithEnzymaticMethod

XULingling，YANGXiaodong*，LIQunli，CHENGuiying，SHENGLiuqing，CHENFei，CAIYunyun

(MedicalCollegeofJinhuaProfessionandTechnologyCollege，JinhuaZhangjiang，321007)

Objective：To research extraction process of esperidin from tangerine peel by enzymatic method.Methods：On the basis of single factor test，the optimum condition of extraction was conducted through response surface methodology.Results：The optimum conditions were as followed：ratio of liquor to material 40∶1(mL·g-1)，pectinase 3.2%，pH 3.0，enzyme digestion temperature of 45 ℃ and enzymolysis time of 2.3 h.Under these conditions，the extraction rate was 5.45%，actually 5.40%.Conclusion：The enzymatic method has advantages in simple operation，higher extraction rate and large scale production.But it is time-consuming and requires large amount of solvents.

Enzymatic methods；response surface methodology；tangerine peel；hesperidin；extraction

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.020

2015-03-06)

浙江省大学生科技创新项目(2013R465005)；浙江省科技厅分析测试项目(2014C37057)

*

杨晓东，教授，研究方向：天然产物的研究与开发；E-mail:jhyxd@163.com