不同生长时期丹参生物量积累及活性成分的变化规律△

赵志刚，郜舒蕊，谢景，闫滨滨，侯俊玲*，王文全，2，3*，宋嬿，张现明，李军

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193； 3.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102；4.上海华宇药业有限公司，上海 200002； 5.临沂市龙康药业有限公司，山东 临沂 273300)

·中药农业·

不同生长时期丹参生物量积累及活性成分的变化规律△

赵志刚1，郜舒蕊1，谢景1，闫滨滨1，侯俊玲1*，王文全1，2，3*，宋嬿4，张现明5，李军5

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193； 3.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102；4.上海华宇药业有限公司，上海 200002； 5.临沂市龙康药业有限公司，山东 临沂 273300)

研究丹参移栽后不同生长时期根生物量积累及4种活性成分的动态变化规律，为丹参的规范化栽培提供理论依据。丹参移栽成活后，在不同的生长阶段进行动态取样，测定各时期丹参根部干物质的量及4种活性成分迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮及丹参酮ⅡA的量，分析全生育期内丹参根生物量及4种活性成分的积累规律，并探讨各成分单株总量及丹酚酸B与隐丹参酮、丹参酮IIA量比值的变化规律。结果表明：在整个生育期内，丹参根部干物质积累呈“慢-快-慢-快”的变化趋势，折干率呈“M”形变化；相同类别活性成分具有较相似的变化规律，各成分量的最大值多出现在根部营养生长初期，而在传统采收期—枯黄期，4种活性成分的量均有不同程度的降低；丹酚酸B与隐丹参酮、丹参酮ⅡA量的比值在8月初便趋于稳定，并一直持续至翌年展叶期；4种活性成分的总量，在整个生育期内具有相似的变化规律，在枯黄期均有所降低，翌年返青时又逐渐升高。明确了不同生长时期丹参根生物量及4种活性成分的积累规律，综合考虑丹参药材产量及活性成分含量，丹参的采收宜在春季萌芽前进行。

丹参；生物量；活性成分；生长时期；采收期

丹参SalviamiltiorrhizaBunge.为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，其干燥的根及根茎是著名活血化瘀中药丹参的重要来源。丹参为临床常用中药，也是国家药品标准收载的320多个中成药的重要原料[1]。由于丹参在治疗心脑血管疾病方面疗效显著，促使市场对原料药材及中成药制品的需求量不断攀升，为缓解供需矛盾，从20世纪60年代开始各地纷纷对丹参进行引种栽培[2]。近年来，丹参的人工种植面积逐年增大，栽培丹参已成为商品丹参的主要来源。笔者对四川、山东、河南、陕西等丹参主产区实地考察后发现，各产区对于丹参的栽培管理仍多停留于传统经验上，缺乏科学的理论指导，造成各地丹参药材质量参差不齐。中药材规范化生产是药材质量稳定、可控的重要保证，规范化的标准操作规程的制定要依据其生长动态的变化特点，只要抓住全生育期不同生长阶段的变化特征，就可以有的放矢地加以管理，因此对丹参生长动态的研究非常必要。

本试验研究了丹参生长过程中单株干物质积累以及迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮及丹参酮ⅡA量的动态变化，并从4种活性成分总量及丹酚酸B与隐丹参酮、丹参酮ⅡA量的比值方面进行了初步探讨，以期为丹参的规范化栽培提供理论依据。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

试验于2012年4月至2013年4月在上海华宇药业有限公司山东临朐丹参规范化生产核心试验示范基地进行。试验所用丹参种苗来自育苗基地2011年7月所育的露地越冬苗，选用的种苗规格保持一致，经北京中医药大学王文全教授鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参S.miltiorrhizaBge.。试验采用单因素随机区组设计，小区面积2×3 m2，3次重复。丹参移栽采用起垄方式，穴栽，垄宽80 cm，每垄栽植双行，三角定苗，株距保持20～25 cm，移栽前结合整地施入N-P-K(15∶15∶15)复合肥及生物有机肥各750 kg·hm-2作基肥，丹参生长期间的田间管理按照常规方法进行。

丹参生长1个月后开始进行动态取样，各小区按照五点取样法采集，每个点3～4株，每小区15～20株，约每月取样一次，取样时间及生长发育时期划分见表1。取样时将丹参根部全部挖出，去掉地上部分及泥土后单株编号，称鲜质量；带回实验室于50 ℃烘箱中干燥，称干质量，并计算折干率。将干燥后的样品切段，四分法取样，粉碎，过40目筛后置干燥器中备用。

1.2 仪器

高效液相色谱仪(LC—2010AHT，岛津公司)；KQ500DE型数控超声波清洗器(功率：500 W，昆山市超声仪器有限公司)；FW100型高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)；BP211D型电子分析天平(德国Sartorius公司)。

1.3 试剂

迷迭香酸对照品(批号：120925)、丹酚酸B对照品(批号：121020)、隐丹参酮对照品(批号：120925)、丹参酮ⅡA对照品(批号：121029)，均购自上海融禾医药科技有限公司，质量分数均大于98%；甲醇、磷酸均为色谱纯(美国Fisher公司)；水为娃哈哈纯净水；乙醇及其他试剂均为分析纯(北京化工厂)。

2 方法

2.1 测定

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取丹参药材粉末约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇100 mL，超声提取10 min(250 W，25 ℃)，放冷，75%乙醇补足减失的质量，取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

表1 取样时间及生长时期划分

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取4种对照品，加甲醇配制成每1 mL含0.105 mg迷迭香酸、0.264 mg丹酚酸B、0.107 mg隐丹参酮、0.096 mg丹参酮ⅡA的储备液。精密吸取迷迭香酸储备液1.2 mL至10 mL容量瓶中，加30%甲醇定容，制成5.04×10-3mg·mL-1的迷迭香酸对照品溶液；精密吸取隐丹参酮储备液2 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成2.14×10-2mg·mL-1的隐丹参酮对照品溶液；精密吸取丹参酮ⅡA储备液2.5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成2.4×10-2mg·mL-1的丹参酮ⅡA对照品溶液；丹酚酸B储备液不予稀释，直接作为对照品溶液。将上述对照品溶液置于4 ℃冰箱中备用。

2.1.3 色谱条件 Wondasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.01%磷酸水(B)；梯度洗脱(0～3 min、30% A，3～5 min、30%～40% A，5～3 min、40% A，13～20 min、40%～58% A，20～22 min、58%～75% A，22～24 min、75% A，24～50 min、75%～85% A)；体积流量1.0 mL·min-1；检测波长286 nm(迷迭香酸和丹酚酸B)和268 nm(隐丹参酮和丹参酮ⅡA)；柱温30 ℃；进样体积10 μL。对照品及供试品色谱图见图1。

1.迷迭香酸；2.丹酚酸B；3.隐丹参酮；4.丹参酮ⅡA。图1 对照品(A)和样品(B)的HPLC图

2.1.4 方法学考察 精密度、稳定性、重复性和加样回收试验等方法学考察，结果均良好。

2.1.5 样品的测定 采用HPLC测定迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的量后求得各生长时期4种活性成分的单株总量，各活性成分单株总量计算公式为：活性成分单株总量(mg)=单株根中各活性成分的量(%)×单株根干质量(mg)，以及丹酚酸B与隐丹参酮、丹酚酸B与丹参酮ⅡA量的比值。

2.2 统计分析

运用SPSS19.0和SIGMAPLOT11.1统计软件对试验结果进行统计分析及图表制作。

3 结果与分析

3.1 不同生长时期丹参根部生物量积累及折干率动态变化

从丹参移栽成活至翌年萌芽前，其根部生物量积累基本呈现“慢-快-慢-快”的变化过程(图2)。丹参在4月中旬移栽后至8月上旬，根干重一直处于缓慢增长状态，干物质积累增加较少；进入8月份，气温逐渐下降，昼夜温差不断增大，丹参地上部分形态基本固定，其进行光合作用制造的有机物开始向下转移，从而进入根部的快速生长期，根干物质快速积累，这一阶段一直持续到10月份；之后，随着气温的继续下降，植株叶片光合作用的功能下降，根部生长趋于缓慢；翌年，丹参萌芽前其单株平均根干重又有小幅增长，较枯黄期增加了28.04%；随着气温升高，丹参开始萌发新芽，根部营养供应地上部分的生长，因此，丹参根部干物质在这一阶段又有所降低。

图2 不同生长时期丹参生物量积累及折干率动态变化

在整个生长期内，丹参根部折干率基本呈“M”形变化趋势(图2)。丹参移栽成活后，随着根生物量的不断积累，折干率逐渐增大，至地上部分营养生长末期达到最大值，为34.17%。8月进入根部生长旺盛初期，这一阶段雨水充沛，根组织膨大占据主导地位，根部伸长、增粗加快，但该时期根部折干率有较大幅度降低，仅为28.73%。此后，随着根部有机物质积累的不断加快，折干率又逐渐增大，至11月中旬丹参地上部分进入枯黄期即传统采收期，此时折干率达到第二峰值，为33.00%。从枯黄期至翌年萌芽前期，丹参根折干率基本不变，但翌年植株萌芽后便有所降低，展叶期丹参根部折干率为29.04%。

3.2 不同生长时期丹参中4种活性成分量的动态变化

丹参药材主要含有两大类活性成分，一类是以丹酚酸B为代表的酚酸类成分，一类是以丹参酮ⅡA为代表的丹参酮类成分。由图3可知，两类活性成分，除在移栽成活后的初始阶段变化不同外，在其余生长阶段具有相似的变化规律。酚酸类成分的动态积累基本呈“W”形，丹酚酸B在5月中旬即植株盛花期量最高，并且这一时期也是整个生长发育阶段其含量的最高点，为14.72%，之后便迅速降低，到7月中旬降至最低点，为6.38%，二者相差1.31倍。随着生长发育进程的推进，丹酚酸B又开始快速积累，8月上旬至9月上旬其含量相对稳定。进入根部快速生长期后，丹酚酸B的量又不断降低，这一降低趋势一直持续到11月中旬即枯黄期，翌年随着新芽萌动其含量又开始逐渐升高，至4月上旬丹酚酸B的量为12.98%。迷迭香酸的变化趋势与丹酚酸B相似，其含量最高值出现在7月中旬，高达1.18%，而最低点则出现在11月中旬枯黄期，仅为0.28%，二者相差3.21倍，翌年返青后其含量又开始升高，至4月上旬迷迭香酸的量为0.49%。

图3 不同生长时期丹参中4种活性成分量的动态变化

在丹参整个生长时期内，隐丹参酮和丹参酮ⅡA的动态积累呈现极为相似的变化趋势。从5月中旬至9月上旬，隐丹参酮和丹参酮ⅡA的量不断积累增加，至9月上旬二者的量均到达最高值，由初始的0.13%、0.27%升高至0.84%和0.79%，分别增加了5.46倍和1.93倍。之后，随着根部的快速生长，隐丹参酮和丹参酮ⅡA的量又出现较大幅度的降低，一直持续到11月中旬枯黄期，翌年，随着新芽萌动二者的量又开始逐渐升高，这一变化趋势与丹酚酸B极为相似，至翌年展叶期隐丹参酮和丹参酮ⅡA的量分别为0.77%和0.67%。

3.3 不同生长时期丹参中丹酚酸B与隐丹参酮及丹参酮ⅡA量比值的动态变化

由图4可知，在整个生长期内，丹酚酸B与隐丹参酮、丹参酮ⅡA量的比值均呈现“L”形变化趋势。丹参移栽成活后的初期，丹酚酸B量最高，而隐丹参酮与丹参酮ⅡA的量最低，丹酚酸B与二者的比值分别为113.23、54.52。随着丹参生长进程的推进，丹酚酸B的量迅速降低，隐丹参酮和丹参酮ⅡA的量逐渐升高，丹酚酸B与隐丹参酮和丹参酮ⅡA量的比值趋于稳定，从8月初开始一直持续到翌年展叶期。经方差分析，丹酚酸B与隐丹参酮和丹参酮ⅡA量的比值在6个时期内无显著差异，其平均值分别为16.59和18.37。

图4 不同生长时期丹酚酸B与隐丹参酮及丹参酮ⅡA量比值的动态变化

3.4 不同生长时期丹参中4种活性成分总量的动态变化

在丹参整个生长期内，4种成分单株总量的变化趋势相似(见图5)。5月中旬至7月中旬为4种成分单株总量的缓慢增长期，这一阶段4种成分单株总量的增幅均较小；但7月中旬之后则进入快速增长期，至9月下旬，即丹参根部速生末期达到高峰，之后随着地上部分逐渐枯萎及根部生长停滞，4种成分单株总量又有所降低，其中，丹酚酸B和迷迭香酸单株总量较高峰期分别降低了53.83%和63.95%，隐丹参酮和丹参酮ⅡA分别降低了70.74%和76.38%。经过冬季休眠，翌年萌芽后4种成分的单株总量又开始逐渐增加，到4月上旬展叶期达到第2个高峰，迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮及丹参酮ⅡA的单株总量分别为2.30×102mg、6.05×103mg、3.50×102mg和3.10×102mg。

图5 不同生长时期丹参中4种活性成分总量的动态变化

4 讨论

4.1 移栽后丹参全生育期内的生长特点

植物的细胞、组织、器官具有一定的生长相关性，它们之间既有密切的协调，又有明确的分工，

既相互促进有彼此抑制[3]。田间观察发现，丹参移栽成活后，在很长一段时间内主要进行地上部分的生长，包括营养生长和生殖生长，这个阶段从丹参移栽成活一直持续至8月，此间气温高、光照强度大，叶片光合作用强，有利于地上部分的生长，该阶段丹参根部生长缓慢，干物质积累较少。植物地上部分和根系是一个有机的整体，相互协调，不可分割，地上部分充足的营养生长是根部生长的必要准备。进入8月份，随着生殖生长的结束，丹参的营养生长中心逐渐转入根部，进入根部快速生长期，这个阶段土温适宜，昼夜气温温差加大，有利于根部的膨大增粗，丹参根干物质快速积累，该阶段一直持续至10月，之后随着气温的继续下降，地上部分趋于衰老，叶片光合作用降低，根部生长缓慢。刘红云[4]采用Logistic曲线方程将丹参根的生长分为3个阶段，认为丹参根干重的增长规律符合S型曲线，8～10月为丹参根部的快速生长期，这一点与本研究结果一致。本研究在丹参传统采收期后，又对第二年萌芽前后其根部的生长变化进行了观测，发现第二年丹参萌芽前其根部干物质还会出现一次小幅增长，萌芽前期丹参根干重较枯黄期提高了28.04%。随着气温的升高，丹参开始萌芽，这时主要靠根部提供营养，萌芽阶段丹参根部干物质有所下降，待叶片展开后便可以进行光合作用，进而开始地上部分的生长。

丹参的药用部位主要为根，因此，在栽培过程中要充分利用其根部的快速增长期，采取适当的田间管理措施，如施肥、灌溉等以促进其快速生长期的生长，这样可以以最低的经济成本获得最佳的经济效益。

4.2 初步认为丹参的适宜采收时间为春季萌芽前

在中药材实际生产过程中，适宜的采收时间和年龄是影响药材产量与质量的关键环节[5]。《名医别录》记载：“其根物多以二月、八月采者，谓春初津润始萌，未充枝叶，势力淳浓也；至秋枝叶干枯，津润归流于下也。大抵春宁宜早，秋宁宜晚，花、实、茎、叶，各随其成熟尔”。可见，制定中药材合理的采收计划需要遵循药用植物的生长规律。《中华人民共和国药典》2010版对丹参采收期的规定为“春、秋二季采挖”[6]。山东、河南、陕西、河北等丹参产区多于霜降前后(10～11月)采挖，少数于次年春季萌芽前采挖。林蔚兰等[2]调查发现秋季采挖的丹参药材质量最好，而春季采挖的丹参根色暗淡，质地松泡，质量下降。也有文献[7]记载，丹参(野生)于农历3～4月或8～9月采根，以春季采的为好。

本研究结果表明，丹参在11月中旬，即传统采收期至翌年萌芽前，根部干物质仍有较大积累。丹参植株耐寒，初次霜冻后茎叶仍能保持绿色，并未完全干枯，因此推测，春季萌芽前丹参根干物质的积累增加可能是由于地上部分养分回流至根部所致，这与《名医别录》中记载的“至秋枝叶干枯，津润归流于下”的说法相似，但这一推断还需要进一步试验研究证实。中药材的采收要兼顾产量和质量综合考虑，而药材质量多以内在活性成分的量进行评价。本研究结果表明丹参中4种活性成分的量多于8～9月份积累最高，之后便开始下降一直持续至11月中旬，第2年丹参萌芽过程中，4种活性成分的量又开始不断增加。据此，初步认为丹参适宜的采收时间应为春季萌芽前。

4.3 丹参中活性成分量的比例关系及其意义还有待进一步研究

药材中各活性成分的比例关系反应了它们在药材中的相对量。作为中药药效物质基础，活性成分的量并非越高越好，其在药材中的相对量可能对其发挥药效起着重要作用。本实验对丹参整个生育期内丹酚酸B与隐丹参酮、丹酚酸B与丹参酮ⅡA量的比值进行了分析，发现两个比值的变化规律极为相似，基本呈现“L”形变化趋势，在丹参移栽成活初期两个比值的数值很大，随后便迅速降低，并很快进入平稳阶段，比值固定，一直持续到第2年展叶期仍未改变。山东产区种植丹参采用育苗移栽的方法，丹参苗在移栽过程中其根系受到一定程度的机械损伤，挖出的种苗不能及时栽种便逐渐失水萎蔫，受到一定的干旱胁迫，因此，笔者推测丹参移栽成活初期丹酚酸B与隐丹参酮和丹参酮ⅡA量的较高比值可能与上述机械损伤或干旱胁迫有关，这些外界因素可能促使丹参种苗中丹酚酸B量较大幅度升高，当然，该推测的合理性还有待于结合严密的试验设计进一步深入研究。

[1] 肖禾，宋民宪.中成药中丹参入药情况的统计分析[J].华西药学杂志，2005，20(3)：279-280.

[2] 林蔚兰，邓乔华，卢绵，等.三个丹参主产区生产情况调查[J].中药材，2008，31(3)：340.

[3] 杨继祥.药用植物栽培学[M].北京：中国农业出版社，1993.2.

[4] 刘红云.丹参生长模拟模型及活性成分积累的调控研究[D].西北农林科技大学，2011.

[5] 段金廒，严辉，宿树兰，等.药材适宜采收期综合评价模式的建立与实践[J].中草药，2010，(11)：1755-1760.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：70.

[7] 山东卫生干部进修学院.山东中药[M].济南：山东人民出版社，1959.

DynamicStudyonBiomassandBioactiveIngredientsAccumulationofRootsofSalviamiltiorrhizaeinDifferentGrowthPeriods

ZHAOZhigang1，GAOShurui1，XIEJing1，YANBinbin1，HOUJunling1*，WANGWenquan1，2，3*，SONGYan4，ZHANGXianming5，LIJun5

(1.SchoolofChinesePharmacy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China； 2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China； 3.EngineeringResearchCenterofGoodAgriculturalPracticeforChineseCrudeDrugs，MinistryofEducation，Beijing100102，China； 4.ShanghaiHuaYuChineseherbsCo.，Ltd，Shanghai200002，China5.LinyishiLongKangChineseHerbsCo.，Ltd.Linyi273300，China)

The paper is aimed to study the biomass accumulation and the content changes of four bioactive ingredients in the roots ofSalviamiltiorrhizaein different growth periods，as to provide theoretical basis for the standardized cultivation ofS.miltiorrhizae.After survival of transplantedS.miltiorrhizae，the biomass accumulation and the content of four bioactive ingredients rosmarinic acid，salvianolic acid B，crytotanshinone and tanshinoneⅡAby dynamic sampling in different growth periods and phonological phases were determined.At the same time，the total content of the four bioactive ingredients and the ratio of salvianolic acid B and crytotanshinone，tanshinoneⅡAin different growth periods were discussed.During the whole growth period，the biomass accumulation ofS.miltiorrhizaeroot showed a “slow-fast-slow-fast” changing trend，dry discount rate showed “M” shape change.The same category active ingredients have withered and yellow phase which is the traditional harvest time，the content of four active ingredients all decreased to some extent.The ratio of salvianolic acid B and tanshinoneⅡAstabilized in early August，and continued until reviving period next year.The total contents of the four bioactive ingredients in the whole growth period showed a similar trend，in the withering period decreasing gradually and increasing during the following year reviving period.It is concluded that the accumulation regular patterns of biomass and four kinds of active ingredients in the root ofS.miltiorrhizaehave been clarified.Comprehensively considering medicinal material production and content of active ingredients，the harvest time ofS.miltiorrhizaeshould be in the spring before bud.

Danshen；biomass；bioactive ingredients；growth periods；harvest time

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.014

2015-01-25)

中药材规范化生产技术服务平台[工信部消费(2011)340]；2011年国家工业与信息化部中药材生产扶持项目

*

侯俊玲，教授，研究方向：中药材质量评价及其产品开发；Tel：(010)84738334，E-mail：mshjl@126.com； 王文全，教授，研究方向：中药材质量评价；Tel：(010)84738623，E-mail：wwq57@126.com