毛细管气相色谱法同时测定斑蝥脂肪油中7种脂肪酸成分的含量△

陈雯玥，白钢钢，袁斐，陈建伟,3*，李祥,

(1.南京中医药大学 基础医学院，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；3.江苏省中药炮制重点实验室，江苏 南京 210023)

·基础研究·

毛细管气相色谱法同时测定斑蝥脂肪油中7种脂肪酸成分的含量△

陈雯玥1，白钢钢2，袁斐2，陈建伟2,3*，李祥1,2

(1.南京中医药大学 基础医学院，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；3.江苏省中药炮制重点实验室，江苏 南京 210023)

目的：建立斑蝥多脂肪酸成分毛细管气相色谱法(GC)含量测定方法。方法：采用石油醚索氏提取斑蝥脂肪油并甲酯化后，以棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸为指标性成分，通过GC同时测定斑蝥7种脂肪酸成分的含量。结果：7种脂肪酸含量存在一定产地差异性。结论：多脂肪酸成分的GC含量测定方法准确、可靠，为建立斑蝥多指标含量测定方法提供依据。

斑蝥；脂肪酸；毛细管气相色谱；甲酯化

斑蝥(Mylabris)为昆虫纲鞘翅目芫青科昆虫南方大斑蝥MylabrisphalerataPallas或黄黑小斑蝥MylabriscichoriiLinnaeus的干燥体，为临床常用中药[1]。斑蝥具有破血逐瘀、散结消癥、攻毒蚀疮的功能，近年来广泛用于肿瘤病、肝炎及皮肤病的治疗[2]。现代研究证明，斑蝥的主要活性成分为斑蝥素(Cantharidin，C10H12O4)，此外尚含脂肪、多种微量元素及蚁酸等[3]。目前，斑蝥活性成分的研究主要集中在斑蝥素及其衍生物的合成、含量测定上，本课题组前期曾对斑蝥的种属药用资源、不同产地斑蝥中化学成分及斑蝥素含量、斑蝥炮制前后脂肪酸成分的GC-MS进行了分析[4-8]。本研究首次采用毛细管气相色谱法(GC)对斑蝥脂肪酸组分进行分析鉴定，以期为斑蝥药材多指标质量控制及其脂肪油资源合理开发应用提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 6820气相色谱仪(FID检测器)；SRADV色谱工作站；KQ-100超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FA1004电子分析天平(上海天平仪器厂，精确度为万分之一)；DHG-910型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；离心机(上海兰科仪器有限公司)；DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精密实验设备有限公司)。

1.2 试药

对照品：SupelcoTM 37 Component FAME Mix(Sigma公司，纯度>99%)。

试剂：正己烷为色谱纯(禹王试剂有限公司)；石油醚(30～60 ℃)、氢氧化钠、甲醇、三氟化硼-乙醚溶液、氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯；水为蒸馏水。

样品：共收集5个产地5批斑蝥样品，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为芫青科昆虫南方大斑蝥MylabrisphalerataPallas 或黄黑小斑蝥MylabriscichoriiLinnaeus的干燥体。样品信息见表1。

表1 斑蝥样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DB-WAX柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；载气(氮气)流量：1.0 mL·min-1；进样口温度：250 ℃；检测器温度：260 ℃；升温程序：50 ℃保持3 min，以25 ℃·min-1的速度升温至200 ℃，保持5 min，再以3 ℃·min-1的速度升温至230 ℃，保持20 min；分流比：20∶1；进样量：1 μL。

2.2 对照品溶液的制备

对照品SupelcoTM 37 Component FAME Mix质量浓度为10 mg·mL-1，按照所需用正己烷稀释成相应浓度。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 脂肪油提取 精密称定斑蝥粉末5.0 g于索氏提取器中，80 mL石油醚70 ℃水浴回流提取6 h，减压回收溶剂，低温烘干得斑蝥脂肪油。计算脂肪油得率，结果见表2。

表2 不同产地斑蝥中脂肪油得率

2.3.2 甲酯化处理 参照GB/T 17376—2008[9]改良测定方法。取上述脂肪油100 mg，精密称定，置于10 mL具塞玻璃管中，加入0.5 mol·L-1氢氧化钠-甲醇溶液4 mL，置60 ℃水浴皂化40 min(至油珠完全消失)，冷却至室温，加入14%三氟化硼-甲醇2 mL，继续水浴5 min，冷却至室温，加入正己烷2 mL，饱和氯化钠2 mL，振摇，静置分层，取上清液200 μL，正己烷定容至5 mL，取适量溶液用无水硫酸钠脱水，12 000 r·min-1离心10 min，即得。

2.4 对照品与样品色谱行为

按照2.1色谱条件，进行斑蝥脂肪油样品及对照品溶液检测，样品与对照品在相同的保留时间处有相应的色谱峰，且与杂质峰得到较好的分离，色谱图见图1。

2.5 线性关系考察

37种脂肪酸混合对照品中各待测组分质量浓度见表3，总质量浓度为10 mg·mL-1。

取质量浓度为10 mg·mL-1的混合对照品溶液，配成下列5个质量浓度梯度：0.5、1、2、4、10 mg·mL-1。其中的浓度为各组分的总浓度。分别取各浓度对照品溶液进样1 μL，按照上述色谱条件，分别以棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯和花生酸甲酯对照品质量浓度为横坐标(μg·mL-1)，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，以质量浓度对峰面积进行线性回归，得回归方程。结果表明，各对照品在一定范围内线性关系良好，结果见表4。

注：A.37种混合脂肪酸甲酯对照品；B.斑蝥供试品；1.棕榈酸甲酯；2.棕榈油酸甲酯；3.硬脂酸甲酯；4.油酸甲酯；5.亚油酸甲酯；6.亚麻酸甲酯；7.花生酸甲酯。 图1 37种混合脂肪酸甲酯对照品及供试品GC图

组分组分(碳原子数∶双键数)质量分数(%)质量浓度/μg·mL-1棕榈酸甲酯C16∶06600棕榈油酸甲酯C16∶12200硬脂酸甲酯C18∶04400油酸甲酯C18∶14400亚油酸甲酯C18∶22200亚麻酸甲酯C18∶32200花生酸甲酯C20∶04400

表4 各脂肪酸组分线性回归方程和线性范围

2.6 精密度试验

取质量浓度为2 mg·mL-1的混和对照品溶液，按照上述色谱条件连续进样6次，每次进样1.0 μL，测定各目标峰峰面积，计算RSD值。结果RSD值均小于2.82%，表明该仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取批号为S060902的河南斑蝥脂肪油，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12 h各进样1次，每次进样1.0 μL，测定各目标峰峰面积，计算RSD值。结果RSD值均小于5.52%，表明供试品溶液中斑蝥素在12 h内稳定。

2.8 重复性试验

取批号为S060902的河南斑蝥脂肪油各6份，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，测定各目标峰峰面积，计算各脂肪酸在脂肪油中的平均含量，计算RSD值。结果RSD值均小于4.94%，表明该方法重复性较好。

2.9 加样回收试验

取批号为S060902的河南斑蝥脂肪油50 mg，精密称定，共6份，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，加入混合对照品溶液各100 μL，依法进样，测定各目标峰峰面积，计算回收率与RSD值。结果见表5～11。

表5 棕榈酸甲酯加样回收率试验测定

注：对照品加入量为1.50 mg

表6 棕榈油酸甲酯加样回收率试验测定

注：对照品加入量为0.50 mg

表7 硬脂酸甲酯加样回收率试验测定

注：对照品加入量为1.00 mg

表8 油酸甲酯加样回收率试验测定

注：对照品加入量为1.00 mg

表9 亚油酸甲酯加样回收率试验测定

注：对照品加入量为0.50 mg

表10 亚麻酸甲酯加样回收率试验测定

注：对照品加入量为0.50 mg

表11 花生酸甲酯加样回收率试验测定

注：对照品加入量为1.00 mg

2.10 样品含量测定结果

取斑蝥药材粉末，精密称定，分别按2.3项下方法制备供试品溶液，并按上述方法同时测定7种脂肪酸甲酯含量。因为样品是经甲酯化后再进行色谱分析，在计算实际含量时，应乘以各自系数，该系数是脂肪酸分子量与对应的脂肪酸甲酯分子量之比。按每克斑蝥生药计，各产地斑蝥药材中7种脂肪酸质量分数结果见表12。

表12 不同产地斑蝥中7种脂肪酸的测定(n=2) (%)

比较各产地斑蝥药材中7种脂肪酸含量，结果表明，以湖北产斑蝥(批号：S091102)为例，各组分含量高低依次为：油酸>硬脂酸>棕榈酸>亚油酸>亚麻酸>棕榈油酸>花生酸，如图2所示。不同产地斑蝥脂肪油种类及其饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例(SFA/USFA)见表13。广西和湖北的斑蝥中SFA/USFA较高，为1.16～1.24；河南、安徽和湖南的SFA/USFA则较低，为0.74～0.81。

图2 湖北产斑蝥脂肪油中7种脂肪酸的含量比较

批号产地饱和脂肪酸(SFA)(%)不饱和脂肪酸(USFA)(%)总量(%)SFA/USFAS060902河南26.4332.5959.020.81S060903安徽39.6553.6593.310.74S060904广西50.7543.7894.531.16S060905湖南31.1539.6470.790.79S091102湖北35.1728.3363.501.24

3 讨论与小结

3.1 色谱柱的选择

为达到良好的分离度和合适的保留时间，实验中比较了不同极性色谱柱的分离效果：HP-5(弱极性)、HP-35(中极性)、DB-WAX(强极性)，结果表明HP-5、HP-35分离效果差，各组分不能达到基线分离，且色谱峰拖尾等情况明显，强极性DB-WAX柱的分离效果良好，对37种脂肪酸甲酯混合对照品中的35种脂肪酸甲酯均能达到基线分离，且峰型良好，满足分析要求。

3.2 甲酯化条件优化

参照并改进了GB/T 17376—2008中的三氟化硼甲酯化方法，以10 mL具塞玻璃试管水浴代替了锥形瓶回流提取，简化操作，可行性更好。

3.3 混合对照品的保存

混合对照品中含有多种不饱和脂肪酸甲酯，结构不稳定，应注意低温保存；溶剂正己烷易挥发，实验中应注意密闭；同时，正己烷对塑料制品有腐蚀性，样品溶液应存放在玻璃容器中。

3.4 斑蝥脂肪油组成分析

GC含量测定结果表明，5个产地的斑蝥脂肪油中各组分含量比存在一定的差异性，但不饱和脂肪酸含量均较高，达到脂肪油总含量的28.33 %～53.65%不等。文献研究表明，油酸、亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，这些物质可能为斑蝥脂肪油抗肿瘤的活性成分[10]。

《中华人民共和国药典》(2010版)与文献研究均以斑蝥素作为斑蝥质量指标性成分[1]，然而斑蝥素有很大毒性，限制了斑蝥的临床应用，至今尚未明确斑蝥临床安全有效剂量范围。本研究首次建立了同时测定斑蝥药材中7种脂肪酸的含量测定方法，方法学考察表明，该方法操作简单，准确可行。研究为斑蝥药材的多指标质量控制提供一定的实验依据，对斑蝥药材中其他成分的药用提供一定参考。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：311.

[2] 蔡慧芸.JNK信号转导通路在去甲斑蝥素诱导肝癌细胞凋亡中的作用[D].石家庄：河北医科大学，2013.

[3] 赵丽娜，张振凌.中药斑蝥的现代研究进展[J].中国民族民间医药，2010，10(9)：33-34.

[4] 张建辉，陈建伟，李祥.斑蝥及其近缘种属药用资源研究进展[J].中国中药杂志，2009，34(6)：647-650.

[5] 张建辉，陈建伟，武露凌，等.南方大斑蝥酸水解-丙酮提取物成分的GC/MS分析[J].中国药房，2009，20(30)：2363-2365.

[6] 张建辉，陈建伟，许金国，等.不同产地南方大斑蝥水解产物化学成分的比较分析[J].天然产物研究与开发，2009，21(3)：449-452.

[7] 刘沁，陈建伟，武露凌，等.斑蝥炮制前后脂肪酸成分的GC-MS分析[J].中国药房，2011，22(19)：1788-1789.

[8] 刘沁，陈建伟，李祥，等.HPLC法测定5个产地斑蝥药材中斑蝥素的含量[J].海南医学院学报，2011，17(5)：582-585.

[9] 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.GB/T 17376—2008 动植物油脂 脂肪酸甲酯制备[S].北京：中国标准出版社，2008.

[10] 王晓峥.硅藻中多不饱和脂肪酸抗肿瘤作用的研究[D].天津：天津科技大学，2010.

Determination of7Fatty Acids from Mylabris by Capillary Gas Chromatography

CHEN Wenyue1，BAI Ganggang2，YUAN Fei2，CHEN Jianwei2,3*，LI Xiang1,2

(1.School of Preclininal Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；3.Jiangsu Key Laboratory for Chinese Materia Medica Processing，Nanjing 210023，China)

Objective：To establish a method for analyzing the chemical constituents of the fatty acids from Mylabris.Methods：The fatty oil of Mylabris was extracted by petroleum ether and analyzed by GC after methyl esterifying.The content of palmitic acid，palmitoleic acid，octadecanoic acid，oleic acid，linoleic acid，linolenic acid and arachidic acid were simultaneously analyzed.Results：Mylabris from different orgins are different in chemical composition of 7 kinds of fatty acid.Conclusion：This study provides an accurate and reliable method to analyze the fatty oils in Mylabris and could be a reference for determination of the content.

Mylabris；fatty acids；capillary gas chromatography；methyl esterification

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.8.008

2015-04-22)

国家公益性行业科研专项(201407002)；江苏省中药炮制重点实验室开放式课题(ZYPZ006)；江苏省高校自然科学研究计划项目(02KJB360004)

*

陈建伟，教授，博士生导师，研究方向：中药品质评价与中药生物技术；E-mail：chenjw695@126.com