内生真菌Trichoderma harzianum次生代谢产物研究△

吕海宁，陈辉，屈晶，李勇，马双刚，刘云宝

(中国医学科学院 北京协和医学院 药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050)

·基础研究·

内生真菌Trichoderma harzianum次生代谢产物研究△

吕海宁，陈辉，屈晶，李勇，马双刚，刘云宝*

(中国医学科学院 北京协和医学院 药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050)

目的：对格木ErythrophleumfordiiOliver的内生真菌菌株Trichodermaharzianum次生代谢产物进行研究。方法：将此内生真菌进行发酵培养，对其发酵液利用色谱方法进行分离纯化，利用波谱方法鉴定得到化合物结构。结果：从其发酵液中分离得到了10个化合物，包括7个环二肽类、2个酚酸和1个嘧啶类化合物，其结构分别为环(R-脯氨酸-甘氨酸)(1)、环-(R-脯氨酸-R-丙氨酸)(2)、环-(S-脯氨酸-R-缬氨酸)(3)、环-(4-甲基-R-脯氨酸-S-正缬氨酸)(4)、环-(R-脯氨酸-R-亮氨酸)(5)、环-(R-脯氨酸-R-苯丙氨酸)(6)、环-(4-羟基-S-脯氨酸-S-亮氨酸)(7)、尿嘧啶(8)、对羟基苯乙醇(9)、间羟基苯乙酸(10)。结论：这些化合物均是首次从该菌株中分离得到。

格木；内生真菌Trichodermaharzianum；次生代谢产物

内生真菌广泛分布于植物体内，并与之产生共生关系。其次生代谢产物与宿主植物次生代谢产物有一定的相似性，但同时也存在特异性，含有多种结构新颖的生物活性物质，是一种重要的药用植物替代或新的药用资源库。本课题组曾对广西产豆科格木属植物格木ErythrophleumfordiiOliver的茎皮进行了系统的化学成分研究，从中分离得到8个具有细胞毒活性的卡萨因型二萜生物碱[1]。从格木茎皮分离得到的一株内生真菌，由中国科学院微生物研究所鉴定为哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)。细胞毒活性(MTT)筛选结果表明Trichodermaharzianum菌株的发酵液95%乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取部位具有一定的体外抗肿瘤活性。因此，本实验对此活性部位的次生代谢产物进行化学成分研究，从中分离鉴定了10个化合物，包括7个环二肽类、2个酚酸和1个嘧啶类化合物，化合物的结构见图1。

图1 化合物1～10的结构

1 仪器和材料

1.1 仪器

XGYU型高压灭菌锅(上海嘉展仪器设备有限公司)；Agilent 1100 Series LC-MSD-Trap-SL型质谱仪；Mercury-400；Inova 500 M；Bruker AVIIIHD 500型核磁共振仪；高效液相色谱仪(日本岛津公司)；P2000型旋光仪(日本Jasco公司)；Hitachi UV-240型紫外光谱仪(日本日立公司)；YMC-Pack ODS-A制备型反相色谱柱、YMC-C18分析型反相色谱柱(日本YMC公司)；反相硅胶、Rp-C18(日本Fuji Silysia公司)；Sephadex LH-20(Amershan Pharmacia Biotech AB)；分析纯溶剂(北京化工厂)；色谱纯溶剂[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。

1.2 材料

本实验所研究的菌株是从广西产格木属植物格木ErythrophleumfordiiOliver的茎皮中分离，并由中国科学院微生物研究所鉴定为哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)。发酵所采用的培养基为GPY培养基：磷酸二氢钾(KH2PO4)3 g、硫酸镁(MgSO4)1.5 g、葡萄糖20 g、酵母浸膏6 g、蛋白胨6 g、水1000 mL。调节pH值至6.0，培养基于120 ～122 ℃，蒸汽灭菌30 min。

2 提取和分离

将经过活化的内生真菌斜面菌种接种于400 mL的GPY液体培养基中，于25 ℃、130 r·min-1的摇床中振荡培养3 d，再取生长良好的菌体培养液转接于发酵罐中，进行放大发酵，于25 ℃发酵3 d，共发酵300 L。

收集糊状发酵物，用纱布过滤分离菌丝体与菌液，菌丝体用95%乙醇浸泡数天，纱布过滤，滤液与菌液合并后上大孔吸附树脂柱，分别用水和95%乙醇水溶液洗脱，95%乙醇水溶液洗脱液经减压浓缩得稠膏850 g。用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩干燥，得乙酸乙酯可溶物80 g。乙酸乙酯可溶物进行硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得5个组分，其中二氯甲烷-甲醇(50∶1)洗脱部分经Sephadex LH-20柱色谱(CH3OH洗脱)纯化去除色素，再经HPLC(乙腈-水)制备，得化合物2(171 mg)、3(60 mg)、5(180 mg)和7(63 mg)；二氯甲烷-甲醇-(30∶1)洗脱部分同样处理后，经HPLC制备，得化合物9(140 mg)和10(34 mg)；二氯甲烷-甲醇(20∶1)洗脱部分经同样处理后，经HPLC制备，得化合物1(70 mg)和6(26 mg)；二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脱部分经同样处理后，经HPLC制备，得化合物4(100 mg)和8(140 mg)。

3 结构鉴定

化合物8：黄色粉末；ESI-MSm/z：113.1 [M+H]+。1H-NMR(500 MHz，D2O)δ：7.65(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，5.91(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)；13C-NMR(125 MHz，D2O)δ：170.3(C-4)，156.0(C-2)，146.3(C-6)，103.9(C-5)。以上数据与文献[8]报道一致，故确定其为尿嘧啶。

化合物9：白色粉末；FeCl3显色反应呈阳性，说明含有酚羟基；ESI-MSm/z：161.3 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.02(2H，d，J=8.5 Hz，H-3，5)，6.73(2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6)，3.63(2H，t，J=5.0 Hz，H-8)，2.65(2H，t，J=5.0 Hz，H-7)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：157.0(C-4)，131.3(C-1)，131.1(C-2，6)，116.4(C-3，5)，64.9(C-8)，39.7(C-7)。以上数据与文献[9]报道一致，故确定其为对羟基苯乙醇。

化合物10：白色粉末；FeCl3显色反应呈阳性，说明含有酚羟基；ESI-MSm/z：175.1 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.00(2H，m，H-2，5)，6.70(1H，overlap，H-4)，6.69(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，3.51(2H，s，H-7)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：176.5(C-8)，157.0(C-3)，132.3(C-5)，129.5(C-6)，123.1(C-1)，120.7(C-2)，116.4(C-4)，36.8(C-7)。以上数据与文献报道[10]一致，故确定其为间羟基苯乙酸。

4 结论

对从格木茎皮中分离的内生真菌Trichodermaharzianum次生代谢产物进行研究，从中分离得到了10个化合物，其中包括7个环二肽类、2个酚酸和1个嘧啶类化合物，这些化合物均是首次从该菌株中分离得到。

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StudyonsecondarymetabolitesofendophyticfungiTrichodermaharzianumLYUHaining，CHENHui，QUJing，LIYong，MAShuanggang，LIUYunbao*

Objective：The secondary metabolites of endophytic fungusTrichodermaharzianum，isolated fromErythrophleumfordiiOliver，were studied.Methods：The endophytic fungus was fermented and the chemical constituents were isolated and purified by various column chromatographies.The structures of isolated compounds were determined by combined spectroscopic methods.Results：10 compounds including 7 cyclic dipeptides，2 phenols and 1 prydine were isolated.Their structures were determined respectively as cyclo-(R-Pro-Gly)(1)，cyclo-(R-Pro-R-Ala)(2)，cyclo-(S-Pro-R-Val)(3)，cyclo-(4-methyl-R-Pro-S-Nva)(4)，cyclo-(R-Pro-R-Leu)(5)，cyclo-(R-Pro-R-Phe)(6)，cyclo-(4-hydroxyl-S-Pro-S-Leu)(7)，uracil(8)，p-hydroxylphenylethanol(9)，m-hydroxylphenylacitic acid(10).Conclusion：All these compounds were isolated fromTrichodermaharzianumfor the first time.

ErythrophleumfordiiOliver；Endophytic fungiTrichodermaharzianum；secondary metabolites

(StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandFunctionofNaturalMedicines，InstituteofMateriaMedica，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100050，China)

2015-02-11)

国家自然科学基金(21132009，81202432)

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刘云宝，副研究员，研究方向：活性天然产物的化学及活性研究；E-mail：liuyunbao@imm.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.004