腰痛宁胶囊有效部位组合对IL-1β诱导大鼠滑膜细胞增殖及IL-6的影响△

张立国，赵丽丽，倪力军*，吴婷婷，史万忠

(1.华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237；2.上海中医药大学 附属曙光医院，上海 200021)

·基础研究·

腰痛宁胶囊有效部位组合对IL-1β诱导大鼠滑膜细胞增殖及IL-6的影响△

张立国1，赵丽丽1，倪力军1*，吴婷婷1，史万忠2

(1.华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237；2.上海中医药大学 附属曙光医院，上海 200021)

目的：研究腰痛宁胶囊组方有效部位的不同组合对IL-1β诱导的大鼠滑膜细胞异常增殖和对细胞因子IL-6分泌的影响，以及各有效部位之间的相互作用关系。方法：大鼠滑膜细胞株RSC-364体外培养传至第2代后，加入腰痛宁拆方及全方共计6个腰痛宁有效部位组合样品，培养48 h，采用CCK-8以及ELISA法分别测定滑膜细胞增殖及IL-6分泌水平。结果：6个腰痛宁拆方及组方样品均能够抑制滑膜细胞异常增殖以及IL-6的分泌，腰痛宁全方的综合活性最佳且其有效部位间存在很强的协同作用。结论：腰痛宁胶囊可有效抑制大鼠滑膜炎，对滑膜细胞具有一定保护作用，腰痛宁胶囊的药引黄酒对于腰痛宁处方中有效部位的细胞活性有重要的促进作用。但可在保证药效前提下减少组方中药或有效部位种类对腰痛宁处方进行精简优化，以增强其质量可控性与安全性。

腰痛宁胶囊；类风湿性关节炎；细胞增殖；IL-6；滑膜细胞

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthrits，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫功能障碍性疾病，滑膜细胞的过度增生以及大量炎症因子的形成会导致关节软骨的破坏[1]。白介素-6(interleukin-6，IL-6)的过量分泌是RA病理作用之一，因此，抑制细胞的异常增殖，以及有效封锁IL-6可控制RA病情的发展[2-3]。腰痛宁是一个有几十年临床应用历史的中药复方制剂，由马钱子粉(调制)、土鳖虫、麻黄、乳香、没药、川牛膝、全蝎、僵蚕、苍术、甘草组成，使用时用黄酒兑少量温开水服用[4]，用于腰腿疼、腰肌劳损和风湿性关节炎等疾病的治疗[5]。腰痛宁处方中众多的组方中药给其药理研究带来很大困难。本课题组前期采用细胞模型研究了含腰痛宁有效部位在内的中药有效部位组合样品的免疫、抗炎和软骨细胞修复活性，并对样品中有效部位间的相互作用类型进行了分析，结果表明腰痛宁全方具有修复骨性关节炎对软骨造成的损伤[6-7]、良好的抗炎活性[8-9]与细胞免疫活性[10]，在这些药理模型下腰痛宁全方中各有效部位间存在协同或叠加作用。

本文利用IL-1β诱导大鼠滑膜细胞建立体外类风湿性关节炎病理模型[11]，探究腰痛宁不同有效部位组合样品对滑膜细胞增殖及细胞中IL-6水平的影响，从细胞药理角度研究腰痛宁有效部位组合对类风湿性关节炎的作用机制。

1 材料

1.1 细胞株

大鼠滑膜细胞株RSC-364(上海中医药大学附属普陀区中心医院实验中心惠赠)。

1.2 药物

制马钱子(批号：Y302-09091-10)、苍术(批号：Y002-101001-2)、麻黄(批号：Y412-100601-12)、土鳖虫(批号：Y803-110101-5)、川牛膝(批号：Y012-110401-1)、僵蚕(批号：Y805-1011054)、甘草(批号：Y013-110301-1)、乳香(批号：110301-2)、没药(批号：110401-1)、全蝎(批号：Y804-11302-4)、黄酒(批号：291110)，均由颈复康药业集团有限公司提供，经该公司执业药师王春民鉴定，样本保存于华东理工大学化学与分子工程学院分析化学实验室，各有效部位的提取及质量分析方法见本实验室前期工作报道[6]。按照各有效部位对应中药在腰痛宁中的投料量，将黄酮、皂苷、挥发油(含水提液)、多糖、黄酒提取物等活性部位依次加入马钱子与麻黄生物碱中，制备6个腰痛宁拆方及全方样品。样品Ⅰ：马钱子生物碱-麻黄生物碱混合物(1∶16)，生物碱混合物简称A；样品Ⅱ：麻黄生物碱-马钱子生物碱-甘草黄酮(1∶16∶3)，甘草黄酮简称F；样品Ⅲ：麻黄生物碱-马钱子生物碱-甘草黄酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷(1∶16∶3∶5∶1)，皂苷类混合物简称S；样品Ⅳ：麻黄生物碱-马钱子生物碱-甘草黄酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷-没药挥发油-乳香挥发油-苍术挥发油-土鳖虫水提液-僵蚕水提液-全蝎水提液(1∶16∶3∶5∶1∶4∶4∶3∶7∶7∶7)，挥发油/水提物混合物简称Ⅴ；样品Ⅳ：麻黄生物碱-马钱子生物碱-甘草黄酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷-没药挥发油-乳香挥发油-苍术挥发油-土鳖虫水提液-僵蚕水提液-全蝎水提液-川牛膝多糖-甘草多糖-苍术多糖-麻黄多糖(1∶16∶3∶5∶1∶4∶4∶3∶7∶7∶7∶5∶7∶2∶3)，多糖类混合物简称P；样品Ⅵ：麻黄生物碱-马钱子生物碱-甘草黄酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷-没药挥发油-乳香挥发油-苍术挥发油-土鳖虫水提液-僵蚕水提液-全蝎水提液-川牛膝多糖-甘草多糖-苍术多糖-麻黄多糖-黄酒提取物(1∶16∶3∶5∶1∶4∶4∶3∶7∶7∶7∶5∶7∶2∶3∶1)，黄酒提取物简称Crw。

1.3 试剂

磷酸盐缓冲液片剂(PBS Tablets，瑞典Medicago AB公司)；DMEM高糖培养基，0.25% 胰酶，双抗(链霉素与青霉素)，两性霉素(美国Biowest公司)；Rat IL-1素(以色列PROSPEC公司)；小牛血清(FBS，美国Gibco公司)；大鼠IL-6 ELISA试剂盒(美国RD System公司)；CCK8试剂盒(日本同仁化学)。

1.4 主要仪器

CO2培养箱(cell 150，德国Heraeus公司)；倒置显微镜(CKX41，日本OLYMPUS公司)；TXZ-92B台式恒温振荡器(上海贺德实验设备厂)；离心机(TDZ4-WS，湖南赛特湘仪)；生物安全柜(美国LABCONCO公司)；酶标仪(EL-340，意大利Bioteck公司)；分析天平(瑞士METTER TOLEDO公司)；恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵(上海予华仪器有限公司)；旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；数显调节仪(余姚新波仪器公司)；真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；超声仪(上海生析超声仪器有限公司)。

2 方法

2.1 受试样品配置

首先精密称取各中药有效部位，将具有热稳定性的有效部位置于烧杯中，加入适量PBS缓冲液，搅拌使之初步溶解，沸水浴加热10 min，待其完全溶解后冷却并加入热不稳定性有效部位进行混合。将腰痛宁拆方及全方样品Ⅰ-Ⅵ分别超声20 min，冷却，定容，配成2500 mg·L-1母液，0.22 μm滤膜过滤并稀释至各浓度(9.77、4.88、2.44、1.22、0.61、0.31、0.15、0.08 mg·L-1)，备用。

2.2 细胞培养与分组

本实验采用大鼠滑膜细胞株RSC-364，待细胞基本长满后传代培养，传至第2代时，调整细胞浓度为1×107·L-1，接种于96孔培养板内用于实验。每孔接种200 μL细胞悬液，接种24 h后把培养孔分为空白对照组、IL-1β对照组、受试样品组，每样3复孔，分别更换相应的培养液：空白对照组换DMEM(含5%FBS、0.02%聚山梨酯-80)，模型组换DMEM(含10 μg·L-1的IL-1β、0.02%聚山梨酯-80及5%FBS)，受试药物换DMEM(含10 μg·L-1的IL-1β、0.02%聚山梨酯-80、5%FBS及各浓度药物)，放入培养箱中继续培养48 h。

2.3 细胞增殖检测

于96孔板进行检测，去除原有细胞培养基，每孔加入100 μL CCK8溶液(含100 μL全培养基及10 μL CCK8试剂)，继续孵育，于给药后3 h置于酶标仪450 nm波长下测定每孔的光密度值(OD值)，并换算半数抑制浓度(IC50)，除此之外，通过绘制标准曲线将OD换算成细胞数，对各受试样品抑制增殖作用进行分析与比较。

2.4 细胞上清液中的IL-6的测定

取前述增殖细胞中原细胞培养基上清液，于96孔板进行检测，全流程严格按照RD ELISA IL-6试剂盒操作说明书进行，使用酶标仪测得吸光度(A)，需将IL-6分泌水平根据对应的细胞的数量进行归一化处理，获得单个细胞IL-6释放量。最后，将IL-6值通过计算换算为IC50，分析及比较各样品对滑膜细胞上清液内IL-6水平的影响。

2.5 数据处理方法[6-10]

所得的实验数据均以半数抑制浓度(IC50)±标准差(SD)表示，该值为各指标抑制率达到50%所对应的药物浓度，由各样品量效曲线结合Origin7.5软件作图得到，数据则通过SPSS18.0进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。为了判断各有效部位之间是协同、叠加还是拮抗作用，本文通过比较样品的IC50实验值与样品中各有效部位IC50的叠加值间的差异来判断有效部位间的相互作用关系。具体方法如下：首先，定义第i个有效部位在样品j中的所占的质量比为Xij，该有效部位的IC50值记为IC50(i)，将样品j中每个有效部位IC50与其在样品中的质量比Xij乘积的和称为样品j的IC50叠加值，记为IC50(Aj)，即

IC50(Aj)=∑iXijIC50(i)

(1)

将样品j的实验IC50值记作IC50(Ej)、其标准差记为SD(j)。假设样品j中的各有效部位间不存在相互作用，则IC50(i)可通过求解obj的极小值获得：

obj=‖∑iXijIC50(i)-IC50(Ej)‖

(2)

1)若IC50(Ej)-SD(j)﹥IC50(Aj)，即样品j中有效部位IC50的叠加值小于实验IC50值，说明各有效部位间发生了拮抗作用；

2)若IC50(Ej)+SD(j)﹤IC50(Aj)，即样品j中有效部位IC50的叠加值大于实验IC50值，说明各有效部位间发生了协同作用；

3)若IC50(Ej)-SD(j)﹤IC50(Aj)﹤IC50(Ej)+SD(j)，即样品j中有效部位的叠加值在IC50的波动范围内，说明各有效部位间存在叠加作用。

以上计算过程通过在MATLAB 2012b的自编程序实现，详细代码见文献的补充材料[8]。

3 结果与讨论

3.1 各有效部位对IL-1β诱导的滑膜细胞增殖以及IL-6水平的影响

采用2.5所述方法计算得到的腰痛宁组方中15个有效部位抑制病理滑膜细胞增殖的IC50值以及IL-6的IC50值，见表1。各有效部位的IC50值与其在组方样品中所占的比例的乘积加和，可求得I～VI号样品的IC50叠加值。

表1 腰痛宁各有效部位抑制滑膜细胞增殖以及IL-6水平的IC50 /mg·L-1

3.2 各腰痛宁样品对IL-1β诱导的滑膜细胞增殖的影响

如图1所示，腰痛宁拆方与全方6个样品对IL-1β诱导的滑膜细胞过度增殖均显示出抑制作用。其中有两种生物碱组成的拆方样品Ⅰ作用最佳，其次是拆方样品Ⅳ及全方样品Ⅵ，三者之间无显著差异。这与文献报道马钱子生物碱对包括滑膜细胞在内的多种细胞增殖具有良好的抑制作用一致[12-13]。比较样品Ⅱ与样品Ⅰ、样品Ⅴ与样品Ⅳ，发现甘草黄酮、总多糖加入后的组方抑制滑膜细胞增殖作用显著降低；比较样品Ⅳ与样品Ⅲ、样品Ⅵ与样品Ⅴ后，发现加入挥发油/水提物、黄酒提取物后的组方抑制滑膜细胞增殖的作用显著提高。

将各样品的实验IC50值与其IC50叠加值进行比较发现，Ⅰ号、Ⅳ号与Ⅵ号样品的IC50(Ej)+SD(j)大大低于其IC50(Aj)，说明这3个样品中的各有效部位之间发生了很强的协同作用，使得这3个样品的实验IC50值在6个样品中偏低；而Ⅱ号样品的IC50(Ej)-SD(j)﹤IC50(Aj)﹤IC50(Ej)+SD(j)，说明Ⅱ号样品的甘草黄酮与马钱子生物碱以及麻黄生物碱间发生了叠加作用；Ⅴ号样品的IC50(Ej)-SD(j)远远大于IC50(Aj)，说明该样品的各有效部位之间存在极强的拮抗作用，因而Ⅴ号样品的IC50为6个样品中最高。Ⅲ号样品的IC50(Ej)-SD(j)略大于其叠加IC50(Aj)，表明该样品有效部位(生物碱、黄酮、皂苷)间有微弱的拮抗作用，且Ⅳ号样品的实验IC50显著低于Ⅲ号样品的IC50，表1结果说明挥发油/水提物抑制滑膜细胞增殖的活性远远强于其他有效部位，加上该部位与腰痛宁组方中药生物碱、黄酮、皂苷间的协同作用，使得挥发油/水提物加入组方Ⅲ后得到的样品Ⅳ抑制滑膜细胞增殖的活性得到显著提高。

注：与Ⅰ相比，☆P<0.01；与Ⅲ相比，★P<0.05；与Ⅳ相比，#P<0.01；与Ⅴ相比，▲P<0.01；与Ⅵ相比，*P<0.05，**P<0.01。图1 腰痛宁拆方及全方样品对滑膜细胞增殖的影响

3.3 各腰痛宁样品对IL-6分泌水平的影响

图2列出了腰痛宁拆方与全方样品对IL-1β诱导的滑膜细胞上清液中IL-6水平影响的半数抑制浓度实验值与叠加值。6个样品对病理滑膜细胞上清液中IL-6的分泌均有不同程度的抑制作用。其中，Ⅳ号样品的作用最为显著，Ⅴ号与Ⅵ号方次之，三者之间的IC50没有统计学差异。Ⅰ号样品由马钱子与麻黄两种生物碱组成，其IC50(Ej)+SD(j)

注：与Ⅰ相比，☆P<0.01；与Ⅱ相比，★P<0.01；与Ⅲ相比，△P<0.01；与Ⅵ相比，*P<0.01。图2 腰痛宁拆方及全方样品对滑膜细胞上清液中IL-6分泌水平的影响

4 结论

本文研究的6个腰痛宁胶囊组方有效部位组合样品均对大鼠RA滑膜细胞炎症有一定的抑制作用，主要表现在对异常增生滑膜细胞的抑制作用及下调炎症因子IL-6的表达，从而抑制炎性滑膜细胞的炎性反应。腰痛宁组方中药中的挥发油/水提物及腰痛宁药引黄酒具有良好的促进腰痛宁有效部位组合样品抑制病理滑膜细胞增殖和滑膜细胞炎症的作用。其中腰痛宁全方样品Ⅵ在两个滑膜细胞模型中均具有很好的药理活性，从滑膜细胞药理角度证明了腰痛宁胶囊的疗效及处方的合理性。从精简处方、提高药物质量可控性与安全性的角度而言，腰痛宁处方仍有一定的优化空间，如以Ⅲ号或Ⅳ号样品为基础减少腰痛宁处方的中药或有效部位种类，可为开发风湿骨病中药新药提供新的候选药物。

[1] Wellby M L，Kennedy J A，Pile K，et al.Serum interleukin-6 and thyroid hormones in rheumatoid arthritis[J].Metabolism：clinical and experimental，2001，50(4)：463-467.

[2] Nishimoto N，Ito A，Ono M，et al.IL-6 inhibits the proliferation of fibroblastic synovial cells from rheumatoid arthritis patients in the presence of soluble IL-6 receptor[J].International immunology，2000，12(2)：187-193.

[3] Nakahara H，Song J，Sugimoto M，et al.Anti-interleukin‐6 receptor antibody therapy reduces vascular endothelial growth factor production in rheumatoid arthritis[J].Arthritis & Rheumatism，2003，48(6)：1521-1529.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：1192.

[5] 倪力军，张强祖，朱立中，等.腰痛宁胶囊治疗腰腿痛、腰肌劳损和风湿性关节炎临床研究的Meta分析[J].中成药，2012，34(9)：1653-1660.

[6] Zhang L G，Ouyang X W，Wu T T，et al.Quantitative evaluation of in vitro effects and interactions of active fractions in a Chinese medicinal formula (Yaotongning Capsule) on rat chondrocytes[J].Journal of ethnopharmacology，2014，155(3)：1424-1432.

[7] 张立国，欧阳霄雯，吴婷婷，等.腰痛宁胶囊药材活性部位不同组合对大鼠软骨细胞的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014，30(10)：151-155.

[8] Ni L J，Xu X L，Zhang L G，et al.Quantitative evaluation of the in vitro effect and interactions of active fractions in Yaotongning-based formulae on prostaglandin E2production[J].Journal of Enthnopharmacology，2014(154)：807-817.

[9] 倪力军，徐晓玲，史万忠，等.腰痛宁胶囊中活性部位的不同组合对PGE2、IL-2、NO细胞因子的影响及其相互作用[J].中草药，2014，45(23)：3424-3431.

[10] 倪力军，郭燕子，徐晓玲，等.腰痛宁对Ana-1细胞免疫功能的影响及其配伍过程的效果评价[J].中成药，2014，36(11)：2252-2257.

[11] 蔡安季，苏卓娃，马文松，等.雷公藤多甙对IL-1β诱导大鼠滑膜细胞株 RSC-364 增殖和 IL-6 分泌的影响[J].放射免疫学杂志，2007，20(6)：546-547.

[12] 杨秀伟，冉福香，吴军，等.马钱子生物碱成分的体外抗肿瘤活性筛选[J].中国现代中药，2006，8(9)：11-13.

[13] 方芳，陈海波，马凤森，等.马钱子生物碱组分对类风湿性关节炎滑膜细胞增殖作用的比较研究[J].浙江中医药大学学报，2013，37(1)：1-4.

Inhibition Effect of Active Fractions in Yaotongning Capsules on IL-1β-induced Synovial Cell Proliferation and IL-6Production

ZHANG Liguo1，ZHAO lili1，NI Lijun1*，WU Tingting1，SHI Wanzhong2

(1.School of Chemistry and Molecular Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China；2.Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM，Shanghai 200021，China)

Objective：To evaluate theinvitroeffects and interactions of active fractions in Yaotongning Capsule (YTNC) by detecting proliferation of interleukin-6 (IL-6) and secretion of rat synovial cell-364 (RSC-364)induced by interleukin-1β(IL-1β).Methods：Six samples including YTNC disassembled prescriptions and the YTNC whole recipe were added to the second generation of culturing RSC-364.After culturing the system for 48 hours，the proliferations of synovial cells and interleukin-6 were examined by cell counting kit-8 (CCK8) assay and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)，respectively.Results：The YTNC whole recipe and YTNC disassembled prescriptions successfully inhibited abnormal proliferation of IL-1β-induced synovial cells，as well as the secretion of IL-6.The YTNC whole recipe showed the best integrated activity among the six samples，and strong synergistic effect was observed among the active fractions of the YTNC whole recipe.Conclusion：YTNC prescription can inhibit rat synovitis deterioration and protect synovial cells to some degree.Moreover，the effects of the combination of YTNC material medicines’ active fractions on the investigated cell activities are obviously stimulated by YTNC’s vehicle，Chinese rice wine.However，in order to improve quality controllability and safety of YTNC without decreasing its efficacy，the categories of material medicines and active fractions in YTNC could still be reduced to get more simple prescriptions.

Yaotongning Capsule；rheumatoid arthritis；proliferation；IL-6；synovial cells

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.010

2014-11-17)

上海市科学技术委员会支撑项目(13401901100)

*

倪力军，博士，教授，研究方向：天然药物研究；Tel：(021)64253045，E-mail：nljfyt@163.com