构建山羊实验性中度牙周炎模型

李 君，乔文静，刘 琪

(1.海口市人民医院口腔科，海南海口570208;2.淄博口腔医院，山东淄博255000;3.遵义医学院附属口腔医院，贵州遵义563003)

牙周病在世界范围内均有较高的患病率，在我国更居于龋病之上。第三次全国口腔健康流行病学调查显示，目前我国成年人中80% ～97%患有不同程度的牙周病且随年龄增长而加重，50～60岁时达到高峰［1］。牙周病会造成牙槽骨缺失、牙齿松动，是老年人失牙的主要原因。随着我国进入老龄化社会，牙周病更将成为突出的影响人类健康和生存质量的问题。有学者认为，缺损牙槽骨的再修复是一项全球性的社会和医学问题，本研究建立山羊中度牙周炎模型，并通过CT三维成像技术观测骨缺损，评价牙周组织再生疗效。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

12只健康成年山羊，雌性，30月龄，体质量30～40 kg(遵义医学院动物中心提供);速眠新(846合剂，长春农牧大学兽医研究所);阿托品、利多卡因(天津药业);牙科用高速、低速手机(上海泽威);Siemens Sensatrion16多排螺旋CT(西门子，德国);Mias病理工作站(四川大学提供)。

1.2 方法

1.2.1 山羊牙周炎模型的建立

采用自体对照法随机分组，12只山羊下颌同一侧的第一前磨牙和第一磨牙为实验组，对侧同名牙为空白对照组。术前常规禁食24 h，12只山羊编号，肌注速眠新0.1 mL/kg麻醉。术前10～20 min肌注阿托品0.03～0.05 mg/kg，固定肢体，于实验侧下颌第一前磨牙、第一磨牙颊侧近远中牙颈部釉牙骨质界处磨固位沟，正畸用结扎丝双股拧成麻花状结扎固定于固位沟处，并用尖头探针机械性破坏牙周附着组织。对照组不作任何处理。两组均用金刚砂细车针在牙槽骨冠方顶部相应根面制备切迹作为组织学测量参照点。分别于第4、10周进行口腔检查及CT扫描;10周后经口内检查、CT及组织学分析均显示为中度牙周炎，即建模成功。

1.2.2 组织标本的制备及指标测量

中度牙周炎建模成功后(10周)处死动物，切除下颌骨，用含100 g/L硝酸、100 mL/L甲醛的脱钙液浸泡标本，3 d观察1次直到脱钙完全。梯度乙醇脱水，石蜡包埋，在颊侧从近中到远中方向做5 μm的连续切片，HE染色，光镜下观察牙周吸收区情况并作形态测量分析(颊侧正中以及与之连续的双侧切片用以形态测量分析)。骨缺损高度(defect height，DH):牙槽骨冠方顶至根方切迹底间距离。

1.3 影像学观察

分别于第4、10周分别采用螺旋CT扫描并进行三维重建，观察牙槽骨吸收情况。扫描参数，探测器:12 mm×0.75 mm，螺旋 5 mm/s，重建层厚0.75 mm;扫描电压120 kV，电流100 mA。扫描时羊麻醉后成侧卧位。显像技术采用多平面重组(multiplanar reconstruction，MPR)。

1.4 统计学分析

用SPSS 13.0软件对所有数据进行分析，数据以均数加减标准差()表示，形态测量及MPR采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)处理所得数据，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大体观察

实验动物口腔卫生状况差，食物残渣较多;实验牙位4、10周均出现牙龈暗红，探诊出血，常伴有自发性出血现象但未见溃疡，无龈上牙石，可探到龈下牙石，4周时牙槽骨丧失不明显，牙周袋深度无明显异常;10周实验侧牙周袋深度均＞6 mm，多为骨下袋，牙齿松动Ⅰ度;对照侧牙龈鲜红，探诊偶有出血，无自发性出血现象，牙周袋深度均＜3 mm，牙齿无松动。

2.2 组织学分析

10周时实验组和对照组均有牙周组织丧失，实验侧较对照侧缺损量大，可见袋内牙骨质暴露;牙周膜间隙增宽明显;根方牙槽骨可见成排的破骨细胞及骨吸收陷窝，骨髓腔内偶见单核细胞(图1)。组织测量结果显示实验组与对照组牙槽骨吸收量有显著差异(P＜0.05)(表1)。

图1 10周病理切片(箭头示骨吸收陷窝)(HE染色，×40)

2.3 CT检查

CT结果显示，实验侧4周时牙槽骨吸收近牙根1/3处，根分叉区密度减低;10周时牙槽骨吸收近牙根1/2，根分叉明显暴露;实验组与对照组各自4周与10周相比牙槽骨丧失均有显著性差异(P ＜0.05)(表1，图2～3)。

表1 牙周组织测量结果(mm，s)

表1 牙周组织测量结果(mm，s)

a.与对照组相比P＜0.05;b.与4周相比P＜0.05，c.与4周相比P＞0.05

组别 n 10周DH 牙槽骨吸收量4周 10周实验组 12 5.082±0.150a 1.763 ±0.264a 4.890±0.246ab对照组 12 1.086±0.270 1.027 ±1.150 1.982±0.310c

图2 二维CT片

图3 CT三维成像片

3 讨论

牙周病是口腔常见病，其复杂的致病因子、发病机制及某些防治措施等常无法直接在人体上进行研究，因此动物实验成为牙周病研究的基本实验方法之一［2］。牙周炎的易感动物种属很多，一般可选用大鼠、狗、金黄地鼠、田鼠、豚鼠、家养雪貂、羊、小型猪及非人类灵长类动物，通常根据实验目的以及实验室条件选择实验动物。猴及狗这类存在伦理学及社会学问题的大型动物通常是在新的治疗方法用于临床治疗前的最后阶段才考虑使用［3］。羊性情温顺，饲养容易，对牙周炎易感，其病因、病理均与人类接近［4］，血清学特点及口腔微生物与人类牙周炎极为相似;羊的牙齿大，其第一前磨牙与人的第一磨牙极其相似，但它的口裂小，前牙与后牙之间有较大的间隔;羊是食草反刍动物有自发性牙周炎的可能且口腔卫生很差，故适合模拟牙周炎自然发展过程建立牙周炎动物模型。

通过在磨牙龈沟内放置结扎材料来增加菌斑聚集、破坏牙龈上皮、增强破骨细胞的作用及骨吸收，可诱导牙周疾病的发生［5］。放置结扎材料可引起牙菌斑及微小溃疡在沟内上皮的聚集，从而有利于牙周致病菌渗透入结缔组织。有研究显示单纯的结扎材料在无菌条件下不会引起动物严重的牙龈炎症或牙槽骨的吸收［6］。细菌是导致牙周组织破坏的始动因子，羊的口腔本身就是个多菌群聚集的环境并且对牙周炎存在着易感性，本实验期待最有效的模拟牙周炎的自然发生过程，因此未额外接种牙周致病菌;采用单纯的机械方法制备羊的中度牙周炎模型，分别于4、10周进行影像学观察并于10周进行组织学观察(由于实验动物数目有限所以4周未进行组织学观察)，可能由于固定及切片操作的问题，组织学方面对牙周软组织的测量不够精确，所以在结果中未引用。现有的结果显示，实验组较对照组牙周缺损量多，10周较4周时牙周缺损量多且根分叉明显暴露，形成中度牙周炎。本结果提示，建立羊的中度牙周炎模型时间为10周。使用CT三维成像技术MPR检测评估牙槽骨吸收情况和根分叉暴露情况更加直观、准确。

［1］崔勇.中西医结合治疗牙周病59例疗效观察［J］.中国当代医药，2012，19(22):114-115.

［2］Struillou X，Boutigny H，Soueidan A，et al.Experimental animal models in periodontology:a review［J］.Open Dent J，2010，4:37-47.

［3］李婧，娄晋宁，徐宝华.实验性牙周炎动物模型的研究进展［J］.中日友好医院学报，2013，27(1):48-49.

［4］Dogan A，Ozdemir A，Kubar A，et al.Healing of artificial fenestration defects by seeding of fibroblast-like cells derived from regenerated periodontal ligament in a dog:a preliminary study［J］.Tissue Eng，2003，9(6):1189-1196.

［5］Cai X，Li C，Du G，et al.Protective effects of baiealin on ligature-induced periodontitis in rats［J］.J Periodontal Res，2008，43(1):14-21.

［6］李婧，娄晋宁，徐宝华.实验性牙周炎动物模型的研究进展［J］.中日友好医院学报，2013，27(1):48-50.