2型糖尿病大鼠肾脏血红素加氧酶-1、Nrf-2表达及Hemin、Znpp的干预效果

王远征 王淑敏(解放军第205医院，辽宁 锦州 2000)

血红素加氧酶(HO)是机体代谢血红素的限速酶，参与许多代谢反应并发挥重要作用，以往研究发现其间接抑制缺血再灌、器官移植炎性反应起保护机体作用。糖尿病发生肾脏损害是一个漫长的过程，HO是否参与了机体代偿并在其中扮演什么角色。体外实验发现氯高铁血红素(Hemin)和锌原卟啉(Znpp)能特异地诱导和抑制HO-1且适量浓度不会引起机体损伤〔1〕，本实验建立2型糖尿病大鼠模型并用上述药物干预，观察HO-1血清学改变、肾脏表达及对肾脏损害的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 Hemin、STZ、Znpp(Sigma);HO-1、ELISA(Stressgen);Nrf-2(Santa Cruz)二抗(中杉金桥)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒、考马斯亮蓝(南京建成)，血糖仪(罗氏)，设备提供(辽宁医学院科技中心)。

1.2 动物 健康8周龄SD大鼠40只，雌雄各半，体重(200±20)g，辽宁医学院实验动物中心提供(合格证SCXK)，按照国家实验动物饲养和使用指南，饲养于光照周期10～12 h，25℃恒温，大鼠自由进食水。

1.3 模型制备与实验分组 适应性饲养1 w后，随机选取10只设为正常对照，常规饮食，选择40只高糖高脂高胆固醇饮食8 w(参照文献方法〔2〕)，一次性腹腔注射30 mg/kg(STZ溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.4)，正常组注射等量生理盐水(0.9%NaCl)72 h后剪尾取血测血糖，选择血糖值 ＞16.7 mmol/L的30只大鼠纳入标准。分为(A)正常组10只、(B)2型糖尿病组10只、(C)2型糖尿病+Hemin(15 mg/kg)组10只、(D)2型糖尿病+Znpp(10 μmol/L)组10只，成模后3 d给药，均隔日一次腹腔注射共4 w。

1.4 标本收集 12 w时2.5%水合氯醛麻醉处死大鼠，股动脉取血离心血清备用，分离肾脏冻存于－80℃待测指标。

1.5 Western印迹 分离肾脏加入裂解液，考马斯亮蓝法提取蛋白并定量，SDS-PAGE电泳，取出胶放入Transfer buffer转至PVDF膜(15V转印15～30 min)，0.01 mol/L PBS洗膜、包被，一抗兔抗Nrf-2(1∶500)、兔抗HO-1(1∶1000)，二抗(山羊抗兔)按说明书操作，显色液均匀滴在PVDF膜上显色，夹起PVDF膜终止反应，全自动凝胶成像分析系统处理。

1.6 血清HO-1含量、活性检测 根据血红素加氧酶降解血红素生成胆红素和CO的原理，以反应物中胆红素生成量计算HO-1活性。取血清按照文献方法用分光光度计测OD值，计算胆红素单位时间生成量，单位 nmol·mg－1·h－1。ELISA法测定血清HO-1蛋白，按照试剂盒说明操作。

1.7 肾脏线粒体MDA、SOD测定 利用MDA可与硫代巴比妥酸生成红色产物在532 nm处最大吸收峰值原理测MDA;SOD抑制超氧阴离子产物显色反应，通过抑制率计算SOD。肾组织低温匀浆4℃离心留取上清液，考马斯亮蓝提取蛋白，595 nm处计算OD值，计算蛋白含量，并测定MDA、SOD，方法按照试剂盒操作。

1.8 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，数据均以±s表示，组间比较采用方差分析，两样本均数间比较采用t检验。

2 结果

2.1 血清HO-1活性和含量测定 见表1。B组明显低于A组(P＜0.05)，C、D组较B组明显提高(P＜0.05)。

2.2 肾脏HO-1蛋白表达 各组HO-1均有表达，OD值计算B组较A组低，C组高于B组、A组，而D组低于B组。见表1。

2.3 肾皮质SOD、MDA测定 见表2。

表1 各组血清HO-1含量和活性的测定(±s，n=10)

表1 各组血清HO-1含量和活性的测定(±s，n=10)

与A组比较:1)P＜0.05;与B组比较:2)P＜0.05，下表同

组别HO-1含量(ng/ml)HO-1活性(nmol·mg－1·h －1)A组19.481±0.5125.8±0.097 B组 14.485±0.2031) 2.526±0.0511)C组 60.701±0.3552) 21.952±1.1032)D组 9.024±0.7172) 1.059±0.0422)

表2 各组肾皮质SOD、MDA变化(±s，n=10)

表2 各组肾皮质SOD、MDA变化(±s，n=10)

组别 SOD MDA(nmol/mg)A组7±0.9092.101±0.422 B组 3.906±0.431) 2.409±0.4271)C组 10.6±0.5332) 2.297±0.5112)D组 2.559±0.3582) 3.171±0.9172)

图1 各组肾脏HO-1表达

3 讨论

糖尿病肾脏损害包括肾小球硬化、肾小管上皮细胞变性、乳头坏死等，临床早期检测24 h尿蛋白排泄率有助于发现肾脏损害，但这项指标病程短的患者容易忽略，以至于病程较长的患者出现肾脏损害已进展加重。动物实验发现糖尿病早期就有肾脏的改变(这基于动物与人体的差异)肾脏体积增大、基底膜样物质增多、肾小管变性、系膜增生、结节型硬化，目前控制血糖外缺乏有效地治疗手段。但可以早期干预肾脏基质增生、纤维化的机制延缓糖尿病肾脏损害。

本文发现血糖升高大鼠体内血清HO-1会降低，而抗氧化能力也会降低。HO是代谢血红素的限速酶，Hb代谢产生的血红素诱导 HO-1释放，能分解血红素产生胆绿素、铁、CO。HO-1能降低氧化应激的损伤物质MDA，并能使抗氧化物质SOD升高。核因子相关因子2(Nrf-2)及其抗炎元件在抗氧化应激中有重要作用。ROS会诱导Nrf-2转入核内，使多种抗氧化酶表达升高其中包括HO-1。而体外研究发现高糖会诱导细胞HO-1表达和活性都升高，但随着高糖作用的时间延长，其表达和活性会下降，一定程度上说明HO-1是种应激蛋白，参与机体损伤早期的代偿〔3，4〕。本文观察到HO-1在糖尿病大鼠会受到抑制，而且氧化应激损伤物质MDA升高，抗氧化SOD下降，于此Nrf-2表达受抑制，可能与HO-1在慢性病的抗氧化作用减弱有关。对冠心病、动脉粥样硬化等慢性病的研究中，HO-1的表达会被抑制，其代谢产物〔5〕与研究一致。本研究对糖尿病大鼠12 w时循环HO-1含量和活性的测定发现，糖尿病大鼠较正常大鼠会表达降低，而血糖维持在较高水平，说明了长期高糖会抑制HO-1表达和活性，而肾脏SOD和MDA的测定则显示糖尿病时大鼠氧化应激明显增强。

我们观察到糖尿病会使HO-1受到抑制，而抑制HO-1活性也会使大鼠血糖升高，而有研究发现诱导HO-1增加并会改善胰岛素抵抗〔6〕，HO-1会调节血糖是否与其刺激胰岛素受体表达有待进一步研究。Hemin会上调HO-1水平但MDA并没有升高反而降低，Nrf-2蛋白也表达增强，Znpp有相反的作用。这是利用产物诱导酶表达的原理，机体内源性产生的大量血红素会损伤组织和器官，而外源性一定时间给予一定量的Hemin会诱导HO-1表达增高，且作用特异不会损伤机体〔7〕，与我们的实验一致。诱导剂和抑制剂干预后的糖尿病大鼠可见其循环HO-1活性和含量的变化，并且Nrf-2改变也很明显，以往研究发现核相关因子会促进HO-1表达，显然HO-1受多种核转录因子影响，改变HO-1会影响Nrf-2水平，是否有反馈机制参与有待进一步研究。Nrf-2在Znpp组表达受抑制而抗氧化应激产物SOD也下降，说明Nrf-2受HO-1影响降低，Nrf-2不足会降低抗氧化水平，与实验〔8〕一致。我们观察到糖尿病会使HO-1受到抑制，而抑制HO-1活性也会使大鼠血糖升高，而有研究发现诱导HO-1增加并会改善胰岛素抵抗〔6〕。抑制HO-1会升高血糖、抑制SOD并使MDA水平升高，加重肾脏的过氧化损伤线粒体和DNA，增加细胞损伤、基质渗出、肾小球纤维化进一步是肾小球硬化。HO-1会调节血糖是否与其刺激胰岛素受体表达有待进一步研究对HO-1涉及的分子机制研究发现〔9〕，其参与了p38MAPK信号通路，总之对糖尿病治疗的研究提供了更广阔的道路。

1 Motterlini R，Foresti R，Intaglietta M.NO-mediated activation of heme oxygenase-endogenous cytoprotection against oxidative stress to endothelium〔J〕.Am J Physiol，1996;39:H107.

2 蒋朝晖，吕玉晶.高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的改良〔J〕.中国比较医学杂志，2011;21(1):33-5.

3 易善红，叶 钢.HO-1在EPO保护小鼠肾缺血再灌注损伤中的作用〔J〕.重庆医科大学学报，2009;(9):1151-3.

4 邢邯英，黄 黛，野战鹰.不同HO-1表达水平对糖尿病模型大鼠血管舒张功能和 NOS的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(23):3061-3.

5 Li M，Kim DH，Tsenovoy PL.Treatment of obese diabetic mice with a heme oxygenase inducer reduces visceral and subcutaneous adiposity，increase adiponectin levels，and improves insulin sensitivity and glucose tolerance〔J〕.Diabetes，2008;57(6):1526-35.

6 Sheng WS，Hu S，Nettles AR.Hemin inhibits NO production by IL-1-stimulated human astrocytes through induction of home oxygenase-1 and reduction of p38 MAPK activation〔J〕.J Neuroinflammation，2010;7:51，1-10.

7 Kappas A，Drummond GS，Valaes T.A single dose of Sn-Mesoporphyrin prevents development of severe hyperbilirubinemia in glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns〔J〕.Pediatrics，2001;108(1):25-30.

8 Turkseven S，Kruger A，Mingone CJ.Antioxidant mechanism of home oxygenase-1 involves an increase in superoxide dismutase and catalase in experimental diabetes〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005;289(2):H701-7.

9 Ndisang JF，Jadhav JF.Up-regulating the hemeoxygenase system enhance insulin sensitivity and improve glucose metabolism in insulin-resistant diabetes in Goto-Kakizaki rats〔J〕.Endocrinology，2009;150(6):2627-36.