晚期非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体突变的检测

王 沣 王继灵 操乐杰 徐修才 伍 权

(安徽医科大学附属省立医院呼吸科中心实验室，安徽 合肥 230001)

研究〔1～3〕表明酪氨酸蛋白激酶小分子抑制剂(TKIs)疗效与表皮生长因子受体(EGFR)基因突变状态关系密切，因此明确EGFR突变类型对选择合适的患者进行靶向治疗十分必要。研究表明采用直接测序法可以对手术切除的肿瘤组织进行全方位的EGFR基因分析，但作为“金标准”的直接测序法对实验条件要求高，且耗时长，步骤繁琐，费用较高，灵敏度低。此外很多患者在诊断肺癌时已经是疾病晚期，无法通过手术切除获得足够的肿瘤组织标本。本研究采用基于PCR技术平台灵敏度高的突变特异性扩增系统(ARMS)法，对晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者胸腔积液脱落细胞、转移性淋巴结及气管镜活检组织标本进行EGFR基因突变分析，并探索检测结果与靶向治疗近期疗效间的临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2011年10月至2012年7月在安徽医科大学附属省立医院呼吸科就诊的、经临床和病理确诊为NSCLC患者共34例，年龄28～82岁，平均63岁;男15例，女19例;吸烟11例，不吸烟23例;PS评分0～1分28例，2～4分6例;恶性胸腔积液22例，转移性淋巴结5例和气管镜活检组织标本7例;肺腺癌30例，鳞癌4例。入组的患者有19例给予TKIs靶向治疗，进行EGFR-TKI治疗前均进行了头颅增强MRI、胸部CT平扫、腹部B超和骨扫描检查，均证实为Ⅵ期患者。

1.2 标本处理 收集NSCLC患者经胸腔穿刺后胸腔积液200 ～250 ml，室温离心 15 min，2500 r/min，取离心管沉淀物1 ml，量少时用胸腔积液补足1 ml。经离心后沉降下来的细胞团，通过细胞学涂片、HE染色，光镜下确定胸水中癌细胞。获取近似100 mg的转移性(N3)淋巴结和气管镜活检组织标本，采用4%中性甲醛溶液固定，在(－20±2)℃条件下保存、运输。

1.3 DNA提取 取先前准备好的恶性胸腔积液脱落细胞、转移性淋巴结和支气管镜活检标本，使用DNA提取试剂盒DNeasy Blood ＆ Tissue Kit(Qiagen，Hilden，Germany)提取 DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。所提DNA使用紫外分光光度计检测浓度。

1.4 EGFR基因突变检测 根据厦门艾德EGFR基因突变检测试剂盒按照产品说明书进行操作，所使用的实时荧光定量PCR仪机型为ABI 7500。

1.5 评判标准 在此次临床试验中，对于非吸烟的患者定义为吸烟总数小于100支，肺癌的病理分型依据最新分类标准，根据国际联盟对癌症转移的定义标准鉴别肿瘤的分期，疗效评估根据RECIST指南，两个月进行一次TKI疗效评估。临床获益率(CBR)=〔完全缓解(CR)+部分缓解(PR)+稳定期(SD)〕/总例 ×100%。

1.6 统计分析 应用SPSS13.0软件进行Fisher确切概率法及非参数秩和检验。

2 结果

2.1 临床特征与EGFR基因突变间的关系 34例NSCLC患者EGFR基因突变率为56%(19/34)，发现19外显子缺失15例，21外显子点突变2例，19、21外显子双突变2例;不吸烟患者突变率高于吸烟患者(P＜0.05);腺癌组突变率高于鳞癌组(P＜0.05)。此外，EGFR突变状态在不同年龄、性别及身体状态评分组别中无明显统计学差异(P均＞0.05)，见表1。

2.2 EGFR突变检出率与样本类型间的关系 胸腔积液脱落细胞、淋巴结及气管镜活检标本中突变阳性突变检出率分别为59%、60%、43%，不同类型标本间ERGR突变均无统计学差异(P＞0.05)。组织学标本EGFR阳性者DNA浓度〔102(52，274)mg/L〕高于 EGFR 阴性者〔72(45，194)mg/L，Z= －0.80，P=0.42〕。细胞学标本中EGFR突变阳性和突变阴性组患者DNA浓度比较差异无统计学意义〔41(39，120)vs 58(39，65)mg/L，Z= －0.10，P=0.92〕。

2.3 EGFR突变状态和TKIs疗效间的关系 19例患者得到TKIs(吉非替尼、埃克替尼)治疗。突变组和野生型组CBR分别为93%(CR 0例，PR 8例，SD 5例)和20%(CR 0例，PR 0例，SD 1例)，二者差异显著(P=0.006)。

表1 EGFR基因突变与临床特征的相关性(n)

3 讨论

尽管肺癌诊断、分期、治疗日趋规范化，由于缺乏有效地早期筛查制度和方法，患者总体预后依然很差，5年生存率仅16%〔4〕。自2004年EGFR基因活性突变被发现以来，针对这一靶点的个体化治疗使NSCLC患者的生存期和生活质量明显提高。研究发现EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，参与肿瘤的生长、侵袭等过程〔5〕。肺癌体细胞EGFR基因突变状态与NSCLC患者分子靶向治疗是否获益有关，突变阳性的患者对EGFR-TKIs尤其敏感，然而野生型的患者几乎不能获益〔1～3〕。可见进行EGFR基因突变检测对选择合适人群进行靶向治疗十分必要。

当前EGFR基因检测方法众多，除局限性较多的“金标准”直接测序法外，ARMS法受到广泛推崇。它具有高特异性和高灵敏度〔6〕的优点，1/100的突变型DNA都可以检出，已成为较成熟的检测EGFR突变方法。本文与先前的研究已经证实在外科切除的亚裔腺癌患者中EGFR基因突变率在55%左右〔7〕。肺腺癌、非吸烟组突变率显著高于鳞癌、吸烟患者，鳞癌组并未发现突变，这可能与本研究的样本量小、入组的多为腺癌患者，且鳞癌的发生EGFR基因突变率低有关，有学者发现非腺癌患者仅10%发生EGFR突变〔8〕。值得关注的是恶性胸腔积液患者，突变阳性率较高的原因一方面可能与入组的患者多为女性、非吸烟、肺腺癌等高选择性易于发生EGFR基因突变人群有关。此外，先前文献〔9〕表明恶性胸腔积液标本中EGFR突变检出阳性率较高，可能与血管内皮生长因子(VEGF)促进胸膜转移有关〔10〕，而表皮生长因子信号通路可能导致VEGF在癌细胞中过度表达〔11〕。

晚期肺癌患者胸膜转移及淋巴结转移均很常见，约7%～15%的肺癌患者疾病发展过程中并发恶性胸腔积液〔12〕，尤其肺腺癌患者更多见。本研究通过操作方便、创伤较小的纤维支气管镜、淋巴结活检及胸腔穿刺引流技术获取微小组织及细胞标本，确认了转移性淋巴结、气管镜活检微量组织标本和胸水脱落细胞标本中应用ARMS法检测EGFR基因突变的可行性，突变检出成功率达100%。孙孟红等〔13〕发现随获取组织样本块的减小，EGFR突变检出率有下降趋势，大标本突变检出率高于中、小标本，特别是细胞学标本明显低于大标本，并解释为小标本所含肿瘤细胞量少，而直接测序法敏感性不高导致漏检所致。本研究表明灵敏度高的ARMS法适合于微小组织样本及细胞DNA标本，较直接测序法更敏感，适用标本范围更广。

近年肺癌异质性倍受关注，Han等〔14，15〕研究表明肺癌原发病灶和胸腔积液及淋巴结之间EGFR基因突变存在不一致性。由于难以获得肿瘤组织标本，入组对象中仅对1例患者原发病灶的气管镜活检标本和转移性胸腔积液、外周血血浆进行配对检测，其中气管镜活检组织标本和胸腔积液脱落细胞检测结果一致，均为19外显子缺失;而外周血并未发现阳性突变，其原因有待于外周血与配对组织进行EGFR基因检测的大样本研究。

综上，在临床无法获得足量手术切除肿瘤组织标本的情况下，ARMS法检测气管镜活检标本及转移性淋巴结、胸腔积液标本是一种行之有效的分子基因检测手段，EGFR基因突变的检测结果可以指导TKIs治疗选择，为肺癌晚期需靶向治疗的患者提供可靠的分子学依据，应用价值广阔。

1 Rosell R，Moran T，Queralt C，et al.Screening for epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer〔J〕.N Engl J Med，2009;361(10):958-67.

2 Jackman DM，Miller VA，Cioffredi LA，et al.Impact of epidermal growth factor receptor and KRAS mutations on clinical outcomes in previously untreated non-small cell lung cancer patients:results of an online tumor registry of clinical trials〔J〕.Clin Cancer Res，2009;15(16):5267-73.

3 Morita S，Okamoto I，Kobayashi K，et al.Combined survival analysis of prospective clinical trials of gefitinib for non-small cell lung cancer with EGFR mutations〔J〕.Clin Cancer Res，2009;15(13):4493-8.

4 Francis H，Solomon B.The current status of targeted therapy for non-small cell lung cancer〔J〕.Int Med J，2010;40(9):611-8.

5 Hynes NE，Lane HA.ERBB receptors and cancer:the complexity of targeted inhibitors〔J〕.Nat Rev Cancer，2005;5(5):341-54.

6 Liu Y，Liu B，Li XY，et al.A comparison of ARMS and direct sequencing for EGFR mutation analysis and tyrosine kinase inhibitors treatment prediction in body fluid samples of Non-small-cell lung cancer patients〔J〕.J Exp Clin Cancer Res，2011;30(1):111.

7 Sonobe M，Manabe T，Wada H，et al.Mutations in the epidermal growth factor receptor gene are linked to smoking-independent，lung adenocarcinoma〔J〕.Br J Cancer，2005;93:355-63.

8 Sasaki H，Shimizu S，Endo K，et al.EGFR and erbB2 mutation status in Japanese lung cancer patients〔J〕.Int J Cancer，2006;118(1):180-4.

9 Soh J，Toyooka S，Aoe K，et al.Usefulness of EGFR mutation screening in pleural fluid to predict the clinical outcome of gefitinib treated patients with lung cancer〔J〕.Int.J.Cancer，2006;119:2353-8.

10 Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors〔J〕.Nature Med，2003;9(6):669-76.

11 Clarke K，Smith K，Gullick WJ，et al.Mutant epidermal growth factor re-ceptor enhances induction of vascular endothelial growth factor by hypoxia and insulin-like growth factor-1 via a Pl3 kinase dependent pathway〔J〕.Bri J Cancer，2001;84(10):1322-9.

12 Antony VB，Loddenkemper R，Astoul P，et al.Management of malignant pleural effusions〔J〕.Eur Respir J，2001;18:402-19.

13 孙孟红，杨 飞，沈 磊，等.非小细胞肺癌中表皮生长因子受体基因突变直接测序分析及其与临床病理特征的相关性〔J〕.中华病理学杂志，2011;40(10):655-9.

14 Han HS，Eom DW，Kim JH，et al.EGFR mutation status in primary lung adenocarcinomas and corresponding metastatic lesions:discordance in pleural metastases〔J〕.Clin Lung Cancer，2011;12(6):380-6.

15 Monaco SE，Nikiforova MN，Cieply K，et al.A comparison of EGFR and KRAS status in primary lung carcinoma and matched metastases〔J〕.Hum Pathol，2010;41:94-102.