BRCA-1、ERCC mRNA在大肠癌组织中的表达及对铂类化疗预后的影响

王先国 陈景华 李 宇 张山燕 周 远 (泰安市肿瘤防治院化疗二科，山东 泰安 271000)

目前铂类化疗方案(即包含奥沙利铂的FOLFOX方案)被认为是化疗的金标准，但是，许多大肠癌患者在接受铂类化疗后出现耐药性，使得化疗失败〔1〕。乳腺癌敏感蛋白(BRCA)-1具有调控基因表达的作用，可对DNA进行重组修复，调节细胞周期，从而能抑制肿瘤的发生，若其功能失活乳腺癌和卵巢癌的发病率将显著提高。研究发现，BRCA-1和核苷酸切除修复交叉互补基因(ERCC)1与铂类化疗耐药性有很大的关联性〔2〕。本研究旨在探讨此两种基因的表达与铂类化疗后患者各项生存指标的相关性。

1 资料与方法

1.1 入选对象 选取我院2007年1月至2010年3月的大肠癌患者58例。所有患者进行手术切除，已经病理证实为大肠癌患者，所选对象中所有患者心、肝、肾功能均正常，未合并两种及以上肿瘤，在术前均未接受过放疗和化疗，并且随访资料完整。排除标准:术前接受过放、化疗患者;哺乳期妇女、孕妇;有精神性疾病患者;两种及以上肿瘤合并患者。58例大肠癌患者中，男38例(65.51%)、女20例(34.48%)，年龄38～82岁，中位年龄62岁。按照TNM分期标准，Ⅰ期6例，Ⅱ期32例，Ⅲ期20例。28例有淋巴结转移，30例无淋巴结转移。

1.2 研究方法 详细记录58例研究对象的姓名、性别、年龄、接受手术时间、病理类型及分期。通过电话随访，对患者的身体状况、疾病复查状况、疾病进展状况、患者死亡原因及时间进行详细记录。以患者死亡为结局，至随访截止仍存活者视为结尾数据。随访至2013年5月结束，随访总时间为70个月。

1.3 化疗方案 应用FOLFOX化疗方案:奥沙利铂(L-OHP)100 mg/m2，静滴，第 1 天;亚叶酸钙(CF)200 mg·m－2·d－1，在5-氟尿嘧啶(5-FU)前2 h静滴，第1～2天;5-FU 400 mg/m2，静脉注射，第1天，然后再用 2400 mg/m2，46 h持续静滴，第1～2天;14 d后重复治疗，共12个疗程。

1.4 试剂 主要包括鼠抗人ERCC mRNA和鼠抗人BRCA-1单克隆抗体试剂盒以及SP试剂盒(即用型)、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(内含底物、显色剂、缓冲液)，应用试剂来自上海研域生物科技有限公司。

1.5 BRCA-1、ERCC mRNA检测 使用快速免疫组化法对BRCA-1、ERCC mRNA进行测定，组织切片取自入选的58例研究对象，实验过程如下:(1)用4%的甲醛对患者组织标本进行固定，制作石蜡切片，经苏木素-伊红(HE)染色后确诊为大肠癌者制作成5 μm切片，置于载玻片上，经烤片后使组织贴于载玻片上，然后对其脱蜡、水化(每例标本均制作两张玻片)。(2)用3%H2O2将玻片培育10 min后，再用蒸馏水按照每次2 min的方法冲洗3次。(3)在每例两张载玻片上，分别滴加1滴BRCA-1、ERCC1单克隆抗体试剂(按1∶100稀释)。(4)将载玻片室温培育，20 min后滴加DAB显色液。(5)蒸馏水冲洗10 min后，用苏木精染色1 min，经酒精分化后，再用氨水返蓝。(6)用蒸馏水冲洗后，使用酒精梯度脱水。(7)二甲苯透明后使用中性树脂将拨片封固。(8)将制好的玻片置于显微镜下找到癌细胞并观察。

1.6 结果判断 高倍镜下观察细胞核，若ERCC mRNA和BRCA-1阳性，则在镜下细胞核中可以观察到棕褐色或棕黄色颗粒沉着物，且此沉着物颜色较背景色明显、细胞结构完整。本实验以Fromowitz为评判标准:(1)阳性细胞所占百分比:10个高倍镜视野中，黄染的阳性细胞的总数与10个视野中所有细胞总和的百分比。细胞阳性数赋值方法，0分:＜5%;1分:5% ～25%;2分:26% ～50%;3分:51% ～75%;4分:＞75%。细胞着色强度赋值，0分:不着色 ;1分:淡黄色;2分:棕黄色;3分:棕褐色。(2)以细胞阳性得分与着色强度得分的乘积判断细胞阳性水平，0～1分:阴性;＞2分:阳性。

1.7 统计学方法 运用SPSS17.0软件进行分析，运用Pearson相关分析，应用Kaplan-Meier法进行生存曲线估计。

2 结果

2.1 BRCA-1实验结果 大肠癌组织切片显示BRCA-1均有表达，其中BRCA-1阳性表达37例(63.8%)，阴性表达21例(36.2%)。不同的分化水平、临床分期、淋巴细胞转移与否与BRCA-1表达差异均有统计学意义(P＜0.05)。BRCA-1阳性表达者平均生存期为(52.00±4.00)个月(95%CI:44.16～59.84)，中位生存期(MST)为48.35个月(95%CI:23.47～64.53);阴性表达者平均生存期为(40.86±3.04)个月(95%CI:34.89～46.82)，MST为 44.58个月(95%CI:38.24～55.77)。BRCA-1阳性与阴性者生存时间之间差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表 1，图1。

2.2 ERCC mRNA实验结果 大肠癌组织切片显示ERCC mRNA均有表达，其中阳性表达25例(43.1%)，阴性表达33例(56.9%)。临床分期、淋巴细胞转移与否与ERCC mRNA表达差异均有统计学意义(P＜0.05)。ERCC mRNA阳性表达者平均生存期为(43.75±4.70)个月(95%CI:34.54～52.96)，MST为36.72个月(95%CI:33.24～47.18);阴性表达者平均生存期为(48.60±1.99)个月(95%CI:44.7～52.5)，MST为48.10个月(95%CI:47.12～48.88)。ERCC mRNA阳性与阴性者生存时间之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2，图2。

2.3 BRCA-1、ERCC mRNA表达水平与生存时间相关性研究经Pearson相关性检验发现，BRCA-1阳性表达及ERCC mRNA阴性表达与生存时间呈正相关性(r=0.651，0.579;均P＜0.01)，即BRCA-1和ERCC mRNA表达水平对经铂类治疗后的患者生存时间均有影响。

表2 ERCC mRNA表达与大肠癌患者临床病理特征的关系〔n(%)〕

图2 不同ERCC mRNA表达患者的生存分析

3 讨论

机体在维持基因表达的过程中，基因组的功能整体性、机体的抗癌过程以及对致癌基因的损伤性修复是极为重要的，而这些功能主要是通过核苷酸切除修复(NER)过程来实现。经研究表明，癌症患者经铂类治疗的效果受DNA修复能力的影响，在NER过程中，ERCC1是一种极其关键的核苷酸内切酶，并且是此过程的重要限速酶，在DNA损伤的识别功能和基因切割修复上起关键作用〔3〕。若ERCC1表达水平低或者无表达，就能导致细胞基因不稳定，增加细胞的恶性程度，癌细胞易出现转移。因此，许多学者将ERCC1认为此基因可能是相关肿瘤患者的预后指标〔4，5〕。BRCA1在基因的损伤修复过程中同样起着重要作用，BRCA-1能够调节G2-M期检测点，其所影响细胞分化过程主要是通过控制细胞有丝分裂时期染色体的分离和重组过程〔6〕。在以小鼠为模型进行的研究中发现，具有BRCA-1基因的人乳腺癌组织生长过程抑制水平低〔7〕。BRCA-1能够对已受损的DNA进行编码，并产生相关蛋白产物，这些产物能够与参与基因修复的蛋白质之间进行相互作用，若BRCA-1表达水平低，则其对基因修复能力减弱，从而机体对铂类药物敏感性增强〔8〕。目前，临床上应用的铂类药物治疗大肠癌患者时，有许多患者产生耐药性，并且不同患者之间对铂类药物的敏感性也有所不同。Chang等〔9〕报道，当DNA受损时，可以通过激活的ERCC1核苷酸内切酶的作用将受损的基因切除，对肿瘤患者进行铂类治疗后，铂类与DNA能够形成加合物，次加合物能够使ERCC1结合XPF因子，进一步激活ERCC1，达到基因修复功能。可见在铂类药物治疗肿瘤患者产生耐药性过程中，ERCC1具有重要意义。Shirota等〔10〕认为，癌症患者ERCC mRNA高表达这总生存期为1.9个月，低表达者总生存期为10.2个月，且差异具有统计学意义。

本研究显示，ERCC mRNA阴性表达患者生存期高于阳性表达患者。这可能是由于阴性表达患者的ERCC1对DNA修复能力减弱，使机体对药物敏感性增大，铂类药物治疗效果明显。在本研究的相关性检验发现，尚不能认为ERCC mRNA表达水平与大肠癌患者的年龄、性别等有关，而阳性表达者经过铂类药物治疗后收益更大。

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3 林 莉，刘晓晴，宋三泰.DNA损伤修复与铂类耐药研究进展〔J〕.中国肿瘤，2006;15(1):29-31.

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5 Hall JM，Lee MK，Newman B，et al.Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome17q21〔J〕.Science，1990;250(4988):1684-9.

6 Park DJ，Zhang W，Stoehlmacher J，et al.ERCC1 gene polymorphism as a predictor for clinical outcome in advanced colorectal cancer patients treated with platinum-based chemotherapy〔J〕.Clin Adv Hematol Oncol，2003;1(3):162-6.

7 Dejardin LM，Arnoczky SP，Clarke RB.Use of small intestinal submucosal implants for regeneration of large fascial defects:an experimental study in dogs〔J〕.J Biomed Mater Res，1999;46(2):203-11.

8 苏丽娅，岳秀兰，曹虹然，等.散发性乳腺癌中BRCA1基因突变的研究〔J〕.中国肿瘤临床杂志，2007;34(5):289-90.

9 Chang IY，Kim MH，Kim HB，et al.Small interfering RNA-induced suppression of ERCC1 enhances sensitivity of human cancer cells to cisplatin〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;327(1):225-33.

10 Shirota Y，Stoehlmacher J，Brabender J，et al.ERCC1 and thymidylate synthase mRNA levels predict survival for colorectal cancer patients receiving combination oxaliplatin and fluorouracil chemotherapy〔J〕.J Clin Oncol，2001;19(23):4298-304.