脑发育期缺碘对大鼠学习记忆功能的影响

[摘要] 目的 探讨脑发育期缺碘对大鼠学习记忆功能的影响。 方法 大鼠饮用含质量浓度为0.3 g/L甲硫咪唑的自来水诱发脑发育不同时期缺碘大鼠模型，E1组为胚胎期缺碘模型鼠，P1组为出生后1～50 d缺碘模型鼠，P30组为出生后30～50 d缺碘模型鼠，N组为正常对照鼠。观察其子代大鼠的行为学改变，利用放免法测定大鼠血清游离三碘甲腺原氨酸（FT3）和四碘甲腺原氨酸（FT4）水平，采用HE染色及TUNEL法观察大鼠的脑组织形态学改变。 结果 P30组的血清游离FT3和FT4水平显著低于N组，差异有统计学意义（P<0.05）。“Y”迷宫实验结果显示，P1和P30组的正确反应率显著低于N组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的达标所需天数显著多于N组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的记忆保持率显著低于N组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的正确反应率、记忆保持率显著低于E1组，达标所需天数显著多于E1组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的正确反应率显著低于P30组，达标所需天数显著多于P30组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组和P30组的皮质细胞凋亡数显著多于N组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的皮质、海马细胞凋亡数显著多于E1组和P30组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的小脑细胞凋亡数显著多于E1组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 脑发育时期缺碘能够导致大鼠学习记忆功能发育障碍，其发生与脑组织细胞凋亡增多有关。

[关键词] 脑发育；缺碘；大鼠；学习记忆功能

[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）07（b）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the influence of iodine deficiency in brain development on rat′s learning and memory functions. Methods Iodine deficiency models of rats in different periods of brain development were induced by drinking tap water containing 0.3 g/L thiamazole.Iodine deficiency of model rat in embryonic period was classified into E1 group，iodine deficiency of model rats 1 to 50 d and 30 to 50 d after birth were named as P1 group and P30 group respectively，and normal control group was set as N group.Change of behavioristics in offspring rats was observed.Serum free triiodothryonine （FT3） and free thyroxine or tetraiodothyronine （FT4） was determined by radioimmunoassay respectively.Morphological change of rat′s brain tissue was observed by HE staining and TUNEL. Results The level of serum FT3 and FT4 in P30 group was lower than that in E1 group and P1 group，with significant difference（P<0.05）.In the “Y” maze experiments，the rate of correct response in P1 group and P30 group N group was lower than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The days of reachting the standards in P1 group was more than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The rate of memory retention in P1 group was lower than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The rate of correct response and memory retention in P1 group was lower than that in E1 group，with significant difference（P<0.05）.The days of reachting the standards in P1 group was more than that in E1 group，with significant difference（P<0.05）.The rate of correct response in P1 group was lower than that in P30 group，with significant difference（P<0.05）.The days of reachting the standards in P1 group was more than that in P30 group，with significant difference（P<0.05）.The apoptosis number of cerebral cortex cell in P1 group and P30 group was more than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The apoptosis number of cerebral cortex and hippocampus cell was more than that in E1 group and P30 group，with significant difference（P<0.05）.The apoptosis number of cerebellum cell was more than that in E1 group，with significant difference（P<0.05）. Conclusion Iodine deficiency in brain development can lead to disorders of learning and memory functions in rats，which is probably related with apoptosis of brain tissue.

[Key words] Brain development；Iodine deficiency；Rat；Learning and memory functions

碘是合成甲状腺激素的必需原料，而甲状腺激素对神经系统发育有重要作用，尤其是对大脑发育，是非常重要的一种激素。如果在脑发育时期碘缺乏或不足，将发生严重的脑功能障碍；如果孕妇孕期缺碘或婴儿出生后母乳、饮食缺碘可出现感觉迟钝、步态异常和智力减弱等症状，而早发现、早诊断、早治疗是防治的关键[1-3]。调查研究显示，脑发育期碘缺乏可引起学习记忆功能障碍及智力低下[4-5]。目前，大多数研究认为这一现象的发生与脑组织细胞凋亡增多密切相关[6]。本研究通过观察脑发育不同时期缺碘大鼠模型学习记忆功能及脑组织形态学的不同变化，探讨缺碘对大鼠学习记忆功能形成及发育的影响，旨在为甲状腺功能减退患儿的临床防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

①实验动物：SD大鼠20只（雌雄比为3∶1），由省医学实验动物中心买进。在实验室常规饲养1周，待其适应环境后，雌雄大鼠按3：1合笼。②主要试剂：甲硫咪唑从美国Sigma公司官网邮购，TUNEL试剂盒由国内南京凯基生物科技发展有限公司提供，放免试剂盒从天津九鼎医学生物工程有限公司邮购。

1.2 方法

1.2.1 缺碘大鼠模型制备[7]及分组[8] 本实验共分4组，具体分组如下。第1组（胚胎期缺碘模型组）：怀孕母鼠从怀孕的第1天开始至仔鼠出生，饮用含质量浓度为0.3 g/L的甲硫咪唑自来水，母鼠在仔鼠出生后的1～21 d（母乳喂养期）饮用正常自来水；仔鼠在出生后21 d断奶，直至出生后50 d的这段时间内饮用正常自来水；雌雄仔鼠分开饲养，简写为E1组。第2组（出生后1～50 d缺碘模型组）：母鼠在仔鼠出生后的1～21 d（母乳喂养期）饮用含质量浓度为0.3 g/L的甲硫咪唑自来水，仔鼠在出生后21 d断奶，直至出生后50 d的这段时间内饮用含质量浓度为0.3 g/L的甲硫咪唑自来水；雌雄仔鼠分开饲养，简写为P1组；第3组（出生后30～50 d缺碘模型组）：母鼠在仔鼠出生后的1～21 d（母乳喂养期）饮用正常自来水，仔鼠在出生后21 d断奶，在出生后30～50 d饮用含质量浓度为0.3 g/L的甲硫咪唑自来水；雌雄仔鼠分开饲养，简写为P30组；第4组（正常对照组）：母鼠和仔鼠均饮用正常自来水，直至仔鼠出生后50 d。

1.2.2 血清游离FT3和FT4的测定 N组出生后第1天和第50天取血，E1组出生后第1天取血，P1和P30组出生后第50天取血。心脏取血经离心后保存，样品全部收集后统一拿到华侨医院核医学科，在专业人员协助下完成测定。

1.2.3 “Y”迷宫实验 本研究选用固定次数随机不休息法[9]，“Y”迷宫实验中的正确、错误判定标准如下：实验大鼠受到电击后，迅速从起步区直接逃到安全区记录为“正确反应”；若是逃到其他无灯光的任何一臂，则记录为“错误反应”；若是实验大鼠转身向所在的起步区反方向逃窜也记录为“错误反应”。各组大鼠在出生后的第45～50天由专人负责实验，每天于相同时间、相同地点，固定训练20次，测试结果分为以下两种：①20次测试中连续正确反应次数≥9次；②20次测试中总的正确反应次数≥18次。如果①和②满足一个，则记为达标。本研究选用正确反应率、达标所需天数、24 h记忆保持率3个指标反映被测大鼠的学习记忆功能。

1.2.4 脑组织形态学检测 各实验组大鼠在出生后的第50天灌注取脑，本研究选用的麻醉方法为腹腔注射350 mg/kg的水合氯醛，首先剪开心包，暴露大鼠的心脏，然后在心尖部位插管到升主动脉，再用止血钳把针头固定，接着再剪开右心耳，快速注入温度为37℃的生理盐水200 ml，再缓慢注入温度为4℃、体积分数为4%的多聚甲醛溶液200 ml。灌注、固定实验步骤完成后，手术取出完整脑组织，将大鼠的大、小脑分别装于盛有体积分数为4%多聚甲醛溶液的容器中浸泡、固定24 h以上，然后做石蜡包埋，常规石蜡切片，每片厚约4 μm，部分切片做HE染色，观察大鼠脑组织的细胞形态学变化。另外，部分切片采用TUNEL法检测细胞凋亡，具体操作方法参考原位细胞凋亡检测试剂盒说明书。各组大鼠随机选取不同脑区的5个视野拍照并计数。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，均数间两两比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清游离FT3和FT4水平的比较

P30组的血清游离FT3和FT4水平显著低于N组，差异有统计学意义（P<0.05）。E1和P1组的血清游离FT3和FT4水平低于检测限或无检测结果（表1）。

2.2 各组“Y”迷宫实验结果的比较

P1和P30组的正确反应率显著低于N组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的达标所需天数显著多于N组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的记忆保持率显著低于N组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的正确反应率、记忆保持率显著低于E1组，达标所需天数显著多于E1组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的正确反应率显著低于P30组，达标所需天数显著多于P30组，差异有统计学意义（P<0.05）。（表2）。

2.3 各组HE染色结果的比较

光镜下N组大鼠的脑组织HE染色结果显示，脑组织分层清晰，细胞数量较多，细胞界限清晰，多有突起，胞质丰富，胞核大而且圆，核仁清晰可见。与N组比较，P1组大鼠的脑组织HE染色结果显示，凋亡细胞皱缩，细胞体积缩小，可见细胞外空隙、胞核固缩、深染（图1）。

P1组和P30组的皮质细胞凋亡数显著多于N组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的皮质、海马细胞凋亡数显著多于E1组和P30组，差异有统计学意义（P<0.05）。P1组的小脑细胞凋亡数显著多于E1组，差异有统计学意义（P<0.05）（表3，图2）。

3 讨论

地方性克汀病又称地方性呆小病，是胚胎期和新生儿期严重缺碘的结果。本病病因比较明确，主要是由于缺碘影响甲状腺激素合成而导致。某些以神经型表现为主的地方性克汀病就是由于胚胎早期严重的宫内碘缺乏损害神经细胞生长发育所致，其临床表现为身高低于正常，其中甲状腺肿大者占15.3%，多数为轻度肿大，智力呈中至重度减退；表情淡漠、聋哑、精神缺陷、痉挛性瘫痪、眼斜视；膝关节屈曲、膝反射亢进，可出现病理反射，如巴宾斯基征阳性；无明显的甲状腺功能减退表现。亚临床型甲状腺功能减退患者尤其是儿童患者，其认知功能损害比较明显，表现为分类、领悟、编码、知识、言语等各项指标均低于对照组[10]。相关研究显示，在脑发育期，缺碘导致的甲状腺功能减退患者记忆能力明显降低[11-12]。先天性甲状腺功能减退大鼠在水迷宫实验中的逃避潜伏期、游泳路程延长，游泳速度减慢[13]。出生后50 d的甲状腺功能减退仔鼠在避暗实验中达标所犯次数明显增多，24 h记忆潜伏期明显缩短[5-6，14]。本研究结果显示，P1组和P30组缺碘大鼠在“Y”迷宫实验中的正确反应率显著降低，P1组缺碘大鼠在“Y”迷宫实验中的达标所需天数显著延长，记忆保持率显著降低，提示甲状腺激素在脑功能发育中尤其是在学习记忆功能的发育和形成过程中有重要作用。

海马一直被认为是认知功能形成和发育的重要解剖结构基础，其参与学习记忆功能的形成。海马中的CA1区域和大脑空间学习记忆功能相关，记忆在这个区域编码、存储。研究显示，有几种重要基因参与学习记忆功能的形成，即早基因在长时记忆形成中发挥重要作用，这一作用和神经元的可塑性有关。甲状腺功能减退时，海马组织中的即早基因表达降低[15-16]，印证了这一观点。缺碘导致的甲状腺激素合成减少可导致海马功能受损，尤其是对学习记忆功能的损害表现更为明显，如水迷宫实验结果更差，而且受损的严重程度和体内甲状腺激素降低或不足的程度、持续时间及发生年龄有密切关系[17]。相关研究显示，即使从母鼠怀孕第6天开始直至仔鼠出生后第30天，母鼠口服较低剂量甲状腺激素合成抑制药物（丙基硫氧嘧啶）引起的甲状腺激素缺乏也可导致仔鼠海马CA1区和锯齿状脑回的突触传递混乱，即突触的可塑性混乱，严重者可引起海马学习记忆功能损害[18]。脑发育期甲状腺激素合成不足或减少可明显导致海马CA1区以及齿状回区LTP的表现和特性出现异常改变[17，19]。相关研究显示，甲状腺功能减退大鼠海马CA3区的LTP明显降低[20]。本研究结果显示，P1组缺碘大鼠的脑组织海马HE染色镜下可见凋亡细胞皱缩、细胞体积明显缩小以及细胞外空隙、细胞核固缩、深染；TUNEL染色可见阳性细胞（凋亡细胞）数明显增多，提示海马发育障碍是脑发育期缺碘导致大鼠学习记忆功能障碍的重要生理病理基础之一。

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（收稿日期：2015-02-06 本文编辑：祁海文）