非小细胞肺癌EGFR基因突变与扩增的比较及其与血清CEA水平的关系

黄宇筠袁润强 陈应智 袁小玲 缪卓峰 庄楚璇

非小细胞肺癌EGFR基因突变与扩增的比较及其与血清CEA水平的关系

黄宇筠★袁润强 陈应智 袁小玲 缪卓峰 庄楚璇

目的 比较分析非小细胞肺癌（NSCLC）表皮生长因子受体（EGFR）基因突变与扩增的关系，并探讨其与血清癌胚抗原（CEA）水平有无相关性。 方法 对270例确诊非小细胞肺癌的肺组织标本（包括手术切除及经纤支镜活检取得）用实时荧光定量PCR法技术检测EGFR基因突变状态，用荧光原位杂交技术检测EGFR基因的扩增情况。治疗前抽取患者静脉血，用化学发光法检测血清CEA水平。 结果 270例NSCLC中EGFR基因突变率为31.11%，EGFR基因扩增率为20%，基因突变并扩增的占10.74%。基因突变组、基因扩增组、基因突变并扩增组和基因无突变无扩增组血清CEA平均水平分别为［3.03（1.68-6.22）］ng/mL、［3.19（1.8-17.17）］ng/mL、［3.39（1.85-20.87）］ng/mL和［2.54（1.5-4.62）］ng/mL。基因突变组与基因扩增组、基因突变组与基因无突变无扩增组血清CEA比较无显著性差异（P＞0.05）。基因扩增组与基因无突变无扩增组、基因突变并扩增组与基因无突变无扩增组血清CEA比较有显著性差异（P＜0.05）。EGFR基因突变、基因扩增及基因突变并扩增与血清CEA水平有明显相关性。 结论 在NSCLC中EGFR基因突变率大于扩增率，其机制有待进一步阐明。EGFR基因与血清CEA水平有明显相关性。血清CEA水平有可能成为指导非小细胞肺癌EGFR靶向治疗的指标。

表皮生长因子受体；突变；扩增；癌胚抗原；非小细胞肺癌

［KEY WORDS］Epidermal growth factor receptor（EGFR）；Mutation；Amplification；Carcinoembryonic antigen（CEA）；Non-small cell lung cancer（NSCLC）

肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤，占癌症死亡率的第一位［1］。非小细胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的75%～85%。由于缺乏早期临床症状，确诊时患者已处于进展期，治疗效果差，五年生存率低于20%［2］。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）靶向治疗的出现给这些患者带来了希望，但其使用需EGFR基因检测的指导，技术要求高，能否用其它指标替代EGFR基因检测，目前少有相关文献报道。本研究通过检测NSCLC患者肺组织中EGFR基因突变和扩增情况及血清CEA水平，探讨EGFR基因突变与基因扩增的关系及EGFR基因与血清CEA是否有联系，希望为临床找出指导EGFR靶向治疗的简单指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年1月至2013年9月中山市人民医院病理科确诊为非小细胞肺癌的肺组织标本（包括手术切除和经纤支镜取得）270例。年龄（59.47±12.22）岁，其中男性 161例（59.63%），女性109例（40.37%）。所有病例未接受过任何治疗。病理标本由两名病理医师采取双盲法进行阅片，标本的组织分型按照2004年世界卫生组织标准进行分类［3］。270例患者中腺癌 192例，鳞癌67例，鳞腺癌4例，大细胞癌6例，多形癌1例。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR法

对所有标本采用实时荧光定量法检测EGFR基因突变情况。采用EGFR基因突变检测试剂盒（北京金菩嘉医疗科技有限公司）及美国AB17500型PCR仪，并严格按试剂盒使用说明操作。

1.2.2 荧光原位杂交法

对所有标本采用荧光原位杂交法检测EGFR扩增情况。采用EGFR基因扩增检测试剂盒（北京金菩嘉医疗科技有限公司）及美国Thermo Brite原位杂交仪，并严格按试剂盒使用说明操作。结果判读：参考Cappuzzo判断标准［4］由2位有经验的病理科医生随机观察细胞 （至少观察100个细胞），统计红信号个数和绿信号个数。当红绿信号比值 ＜2，为阴性结果。当红绿信号比值 ＞2或红色信号成族状排列，为阳性结果。

1.3 统计学方法

2 结果

270例NSCLC中EGFR基因突变有84例，突变率31.11%。EGFR基因扩增有54例，扩增率20%。同时存在EGFR基因突变及扩增的有29例，占10.74%。EGFR基因与临床病理特征关系见表1。EGFR基因阳性组与阴性组比较，患者年龄小、女性多见、肿块较小、腺癌多见，纤支镜下阳性率低。各组血清CEA水平见表2。各组血清CEA水平比较见表3。基因突变组与基因扩增组、基因突变组与基因无突变无扩增组血清CEA比较无显著性差异（P＞0.05）。基因扩增组与基因无突变无扩增组、基因突变并扩增组与基因无突变无扩增组血清CEA比较有显著性差异（P＜0.05）。EGFR基因突变组、EGFR基因扩增组、EGFR基因突变并扩增组均与血清CEA水平有相关性（χ2分别为4.060、4.314和4.956，P均小于0.05）。

表1 EGFR基因与临床病理特征关系Table 1 The relation of EGFR gene and clinicopathological characteristics

表2 各组血清CEA水平（ng/mL）Table 2 The level of serum CEA in each group（ng/mL）

表3 EGFR各组CEA水平的比较Table 3 Comparison of the serum CEA in each EGFR group

3 讨论

大量试验及文献已证明EGFR基因突变在亚州人种、女性、非吸烟、腺癌患者中发生率较高。本研究中，EGFR基因阳性组中女性多见、腺癌多见，与之相符。EGFR是由1 186个氨基酸组成的相对分子量为170×103的膜蛋白，其与相应的配体结合后发生二聚体化，引起质膜或胞内酪氨酸残基特异蛋白激酶从无活性转为有活性的形式，从而对作用底物的某些酪氨酸残基进行特异磷酸化［5］。它控制着细胞的增殖、生长、分裂、分化，当中任何一环节受到干挠或破坏，细胞的增殖、生长、分裂、分化就会转为失控状态。在非小细胞肺癌中，EGFR呈高表达状态。基因突变是指DNA或基因中单个碱基对的改变。基因扩增是指某一些特定亚染色体区段拷贝数的增加，而不包括整个基因组、染色体、臂或大片段染色体区的扩增。EGFR基因扩增通常意味着这些基因的过度表达。Hirsch等［6］检测了 69例非小细胞肺癌患者EGFR蛋白及基因复制情况，统计分析显示蛋白表达与基因复制密切相关 （P＜0.001），其中有EGFR基因的扩增的患者其EGFR蛋白全部呈过度表达。Dziadziuszko等［7］报道66例NSCLC病人的EGFR mRNA含量与基因扩增密切相关（P=0.001），进一步证实 Hirsch等［6］的报道。EGFR基因突变与扩增同时存在的现象已被多个研究证实。本研究也观察到此现象（占10.74%）。有研究报道EGFR基因突变与扩增并存从而影响EGFR的表达，据此我们曾推测EGFR基因突变可能通过基因扩增从而影响EGFR的表达，但Dziadziuszko等［7］的研究结果同时也显示mRNA的表达与突变无关（P=0.19），且本研究发现EGFR基因突变率大于EGFR基因扩增率（基因突变率为31.11%，而基因扩增率为10.74%）。究竟EGFR基因突变与扩增之间是一种什么样的关系，是否存在另外的机制影响EGFR的表达，有待进一步研究。本研究EGFR基因突变率大于扩增率，与刘红雨等［8］所做的EGFR基因扩增率大于突变率相反。造成结果的不一致的原因可能为：两个研究中入选对象的一般情况不相同，Paez等［9］报道EGFR基因突变率在不同的NSCLC患者中不同，其中在女性、腺癌和不吸烟患者中突变高。

CEA属于细胞表面的糖蛋白家族，存在于细胞膜上，为免疫球蛋白超家族成员中的细胞粘附分子，具有同嗜和异嗜粘附功能。其通过破坏细胞的极性抑制细胞凋亡，抑制细胞分化，从而导致肿瘤的发生［10-11］，在肿瘤转移中可能起重要作用［12］。在非小细胞肺癌中大约有35%～60%患者血清CEA水平升高。血清CEA升高被认为是不利的因素，尤其是肺腺癌［13］。本研究中，EGFR基因突变与血清水平有明显的关联性，与Shoji等［14］研究结果血清CEA水平与EGFR基因突变有关相符，这可能是由于EGFR突变下游分子激活促进抗凋亡发生，从而提高了作为抗凋亡产物CEA蛋白的表达水平所致。有文献报道［15］EGFR基因突变与EGFR基因扩增有明确的相关性，但本研究EGFR基因突变组与基因无突变无扩增组的血清CEA水平无统计学差异，而基因扩增组与基因无突变无扩增组血清CEA水平却有统计学差异，此可能为EGFR基因和血清CEA水平之间是通过复杂的分子网络相互作用，而不仅仅由基因突变所致，基因扩增可能在该过程中起着重要的作用，但基因突变组与基因扩增组血清CEA水平无统计学差异，我们推测CEA水平的升高，可能还有另外的机制在作用，此有待进一步研究。从本研究结果可看出，基因突变并扩增组的CEA水平比有基因突变或扩增组高，这提示在促进CEA升高的复杂机制中基因突变与扩增两者起相互加强的作用。目前已经明确EGFR基因突变成为非小细胞肺癌服用EGFR-TKI药物的关键疗效预测指标［9，16］，Gupta等［17］提出EGFR基因扩增可能也是EGFR-TKI临床疗效的一个预测因子。有研究表明血清CEA水平在女性、腺癌及脑转移患者明显升高［18］，与EGFR酪氨酸激酶抑制剂 （tyrosine kinase inhibitor，TKI）治疗的优势人群相似［19］。袁帅飞等［20］研究示血清CEA水平是NSCLC患者EGFR突变状态的预测指标之一。在中国的肺腺癌患者中，血清CEA水平也可预测EGFR基因的突变率［21］。当术前血清CEA表达水平在一定的范围内，EGFR基因突变率随着术前血清CEA浓度的升高而增高［22］。赵玲娣等［23］证实：非小细胞肺癌患者中血清CEA水平比血清CEA水平低者有更好的TKI疗效。结合本研究结果，我们可以得出结论：对不能获取手术标本进行EGFR基因检测时选择血清CEA阳性的NSCLC患者接受EGFR的靶向治疗，可能会取得同样的疗效。但究竟血清CEA多高才能预示EGFR突变、血清CEA多高我们才使用TKI治疗，目前尚无相关研究报道。血清CEA与EGFR两者之间的关系还有待进一步研究详细阐明。

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The comparing of EGFR gene mutation and amplification and its relationship with the serum CEA in non-small cell lung cancer

HUANG Yujun★，YUAN Runqiang，CHEN Yingzhi，YUAN Xiaoling，MIAO Zhuofeng，ZHUANG Chuxuan （Respiration Department， Zhongshan General Hospital， Zhongshan Affiliated Hospital， Sun Yat-Sen University，Zhongshan，Guangdong，China，528400）

Objective To explore the correlation between the epidermal growth factor receptor （EGFR） gene mutation and its amplification in patients with non-small cell lung（NSCLC），and discuss whether it is relevant with the serum carcinoembryonic antigen（CEA）.Methods 270 lung tissue samples diagnosed with NSCLC（including surgical resection and biopsy by bronchoscopy）were taken in.EGFR gene mutation，EGFR gene amplification and serum CEA were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction，fluorescent in situ hybridization and chemiluminescence before treatment，respectively.Results The rate of EGFR gene mutation，EGFR gene amplification，and EGFR gene mutation and amplification were 31.11%，20%，and 10.74%in the 270 cases of NSCLC.The average level of serum CEA in gene mutation group，gene amplification group，gene mutation and amplification group，and gene no mutation without amplification group were［3.03（1.68-6.22）］ng/mL，［3.19（1.8-17.17）］ng/mL，［3.39（1.85-20.87）］ng/mL and［2.54（1.5-4.62）］ng/mL，respectively.There were no significant differences in the level of serum CEA （P＞0.05）in gene mutation group and gene amplification group，gene mutation group and gene no mutationwithout amplification group，respectively.There was significant differences in the level of serum CEA（P＜0.05）in gene amplification group and gene no mutation without amplification group，gene mutations and amplification group and gene no mutation without amplification group，respectively.EGFR gene mutation，gene amplification，gene mutation and amplification were significantly correlative with the level of serum CEA.Conclusion The rate of EGFR gene mutation was higher than that of EGFR gene amplification in the NSCLC.The mechanism remains to be elucidated.There is a significant correlation in EGFR gene and the level of serum CEA.The serum CEA maybe become a marker for guiding EGFR targeted therapy in NSCLC.

国家“863”计划（2011AA02A110）

中山大学附属中山医院，中山市人民医院呼吸内科，广东，中山 528400

黄宇筠，E-mail：sxhyj@126.com