miR-93在急性髓系白血病中的表达及其与 miR-378表达的相关性

汤琴，尹家瑜，朱晓雯，张盈盈，周静东，邓兆群（.江苏大学附属人民医院血液科，江苏 镇江 22002；2.江苏大学附属金坛医院血液科，江苏 金坛2200；.江苏大学附属人民医院中心实验室，江苏镇江 22002）

miR-93在急性髓系白血病中的表达及其与 miR-378表达的相关性

汤琴1，2，尹家瑜1，朱晓雯1，张盈盈1，周静东1，邓兆群3
（1.江苏大学附属人民医院血液科，江苏 镇江 212002；2.江苏大学附属金坛医院血液科，江苏 金坛213200；3.江苏大学附属人民医院中心实验室，江苏镇江 212002）

目的：探讨微小RNA-93（miR-93）在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中的表达特点及其与miR-378表达的相关性。方法：用实时定量逆转录 聚合酶链反应（RQ-PCR）检测84例AML患者及16例健康对照骨髓单个核细胞中 miR-93成熟体的表达水平。分析 miR-93高表达对 AML患者预后的影响及其与 miR-378表达的相关性。结果：84例 AML患者中有14例过表达 miR-93（16.7％）。miR-93高表达组患者除白细胞数（3.11× 109/L）明显低于低表达组（14.55×109/L，P=0.003）外，其他参数如性别、年龄、血红蛋白和血小板等均无明显差异。与其他核型分组［10/38（26.3％）］比较，中等预后核型分组中 miR-93高表达的频率明显下降［4/46（8.7％），χ2=4.652，P=0.041］。Spearman相关系数分析显示，miR-93表达率与 miR-378表达率呈正相关（r=0.321，P＜0.01）。结论:miR-93在 AML中表达率明显增加，且与miR-378表达率呈正相关。miR-93联合 miR-378的表达可能作为 AML诊断的参考依据。

微小 RNA；微小 RNA93；急性髓性白血病

［Abstract］Objective:To investigate the expression of miR-93 in acute myeloid leukemia（AML）patients and the correlation between miR-93 and miR-378.Methods:Real-time quantitative PCR was performed to detect the expression level of miR-93 in AML patients.The clinical significance of miR-93 expression in AML was investigated.Results:miR-93 overexpression was identified in 14（16.7％）of 84 AML patients.The patients with miR-93 overexpression had lower white blood cell level than those without miR-93 overexpression（3.11×109/L versus 14.55×109/L，respectively，P=0.003）.Compared with other karyotype classifications，the frequency of miR-93 overexpression in the intermediate ones was lower［4/46（8.7％）versus 10/38（26.3％），P=0.041］.Spearman correlation analysis revealed positive association between the two miRNAs，with r=0.321 between miR-93 and miR-378.Conclusion: miR-93 might serve as a diagnostic molecule with miR-378 in AML.

［Key words］microRNA；miR-93；acute myeloid leukemia

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，表现为造血祖细胞的分化和增殖异常，从而导致致命性的感染、出血、器官浸润等［1］。微小RNA是一类长度约为20～22 nt的真核生物内源性小分子非编码单链RNA，参与人体内多种重要的生理过程，包括细胞的分化、增殖和凋亡等［2］。近年来研究显示，微小RNA与 AML的发生发展密切相关。miR-93能够促进肿瘤的生长、血管的形成以及细胞的增殖［3-4］。miR-93的表达在神经母细胞瘤、非小细胞肺癌以及乳腺癌中均明显增高，且与胃癌的预后密切相关［5-8］。众多研究表明，miR-93和 miR-378都是促癌基因［3，9］。但是，miR-93在AML中的表达状况及其与 miR-378表达的相关性尚未见报道。我们检测了急性髓性白血病患者骨髓单个核细胞中miR-93的表达量，并对其与 miR-378表达的相关性进行了分析。

1 对象与方法

1.1 病例

84例AML患者均为2005年10月至2014年3月在江苏大学附属人民医院接受住院治疗的初诊病例，其中男48例，女36例，年龄10～87岁（中位53岁），诊断按 FAB和WHO 2008版标准（原始细胞≥20％）［10-11］。核型分析应用常规 R显带技术，核型分组按照文献［12］进行。对照组16例为疑似白血病患者，后经骨髓穿刺病理学后而排除，且未患其他疾病。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离与 RNA制备 全部患者均于初诊时抽取骨髓10 mL，肝素抗凝，用 Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，应用 mirVana miRNA试剂盒提取总RNA（Ambion公司，美国），经紫外分光光度仪检测 RNA浓度及纯度［D（260 nm）/D（280 nm）比值在1.8～2.0间］，-80℃保存备用。

1.2.2 反转录

20 μL反应体系包括蒸馏水14 μL、缓冲液4 μL、RNA 1 μL、反转录酶1 μL（Qiagen公司，miScript Reverse Transcription Kit Cat.218061）混匀离心。PCR程序包括两步:①37℃1 h，②95℃5 min，随后4℃保持。

1.2.3 RQ-PCR检测样品中 miR-93成熟体的表达

引物设计采用 Primer Premier 5.0软件，miR-93特异引物序列为5′-CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGT-3′。内参为U6管家基因，上游引物为5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下 游 引 物 为 5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物由上海基康生物技术有限公司合成。20 μL PCR反应体系包括赛博绿 PCR混合溶液10 μL，1.0 μmol/L的通用引物2 μL，以及1.0 μmol/L的特异性上游引物。反应在ABI 7300扩增仪（Applied Biosystems公司，美国）上进行，扩增条件为95℃预变性15 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸34 s，共40个循环，熔解曲线程序为95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，60℃15 s。每次扩增均以重组 miR-93质粒为阳性对照，以双蒸水作为无模板对照（NTC）。选取 miR-93与U6表达ΔCT值最小的1例对照标本作为参比对照，设定为1。miR-93基因表达量的计算采用如下公式:；ΔCT指对照与标本之间miR-93与 U6循环阈值（CT）的差值。熔解曲线揭示PCR产物为单一峰。随机选取2例 PCR产物进行测序证实序列正确。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理。计量资料间的差异分析采用 Kruskal-Wallis（多组间比较）或 Mann-Whitney U检验（两组比较），计数资料的差异分析采用卡方检验或 Fisher确切概率法；miR-93表达与临床资料之间的相关性分析采用Spearman秩和检验；生存时间分析采用 Kaplan-Meier法；用 Spearman相关系数分析 miR-93与 miR-378的相关性；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-93在两组中的表达

16例对照的 miR-93表达水平在0.001316～1.000000（0.19±0.24）。因此，以0.43（均数 +标准差）为界将 AML组分为高表达组和低表达组。84 例AML患者中有14例（16.7％）为过表达miR-93。相应对照组 miR-93的高表达率为6.25％（1/16）。对照组和 AML组的 miR-93的表达水平差异无统计学意义。

miR-93高表达组白细胞计数明显低于低表达组（P=0.003），两组其他参数如性别、年龄、血红蛋白和血小板间的差异均无统计学意义。见表1。AML组每个亚型都有 miR-93高表达的病例，但各型之间的高表达率无统计学意义。与其他核型分组［10/38（26.3％）］比较，中等预后组中 miR-93高表达的频率明显降低［4/46（8.7％），P=0.041］。

2.2 miR-93对预后的影响及与 miR-378的相关性

为了观察AML患者中 miR-93高表达对患者预后的影响，我们对 84例患者中的 80例患者（失访4例）进行了生存分析，其中高表达组14例，低表达组66例。在完全缓解的43例中高表达组9例（64.3％），低表达组34例（51％）。两组完全缓解率间的差异无统计学意义（P=0.566）。所有患者中，生存总人数为34例，其中高表达组6例，低表达组28例，两组（又各有1例失访）的总体生存率的差异也无统计学意义［46％（6/13）与 43％（28/ 65），χ2=0.292，P=0.589］。在获得完全缓解的AML患者中，miR-93高表达组和低表达组无复发生存率的差异也无统计学意义［75％（6/8）与84％ （27/32），χ2=0.341，P=0.559］。Spearman相关系数分析结果显示，miR-93与miR-378之间有明显相关性（r=0.321，P＜0.01）。见图1。

表1 急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞miR-93表达水平与临床参数的关系

3 讨论

AML的致病机制与染色体异常和蛋白编码基因等密切相关。近年来，miRNA在 AML发生发展中的作用以及调控机制已经成为研究的热点和焦点之一。多数研究表明 miR-93能够促进多种肿瘤的发生发展［3，8，13］。但miR-93在 AML中的作用机制还不明确。

图1 Spearman相关系数分析miR-93与miR-378间的相关性

本研究测定了84例 AML患者以及16例对照的骨髓单个核细胞中miR-93的表达水平，并进行统计分析。结果显示，84例AML患者中有14例为过表达 miR-93（16.7％），提示 miR-93表达可能作为诊断AML的生物分子，今后需要更多病例进行验证并进行 miR-93与 AML的相关性研究。miR-93高表达组与低表达组相比，除了白细胞计数低以外（3.11×109/L与14.55×109/L，P=0.003），其他参数如性别、年龄、血红蛋白和血小板间的差异均无统计学意义。Zhu等［14-15］通过测定患者血清 中的miR-93以及其他一些微小RNA的表达水平，推断可以将多种微小 RNA一起作为非小细胞肺癌和AML的分子诊断学依据。Spearman相关系数分析得出 miR-93与 miR-378具有正相关性（r=0.321，P＜0.01）。而我们以前的研究表明 miR-378对AML的发生发展以及预后可能有重大的意义［16］。miR-378和 miR-93已经被证实与肿瘤的形成相关［3，9］。此次研究虽未有明确的数据证明 miR-93 对AML患者的预后有影响，但是miR-93与miR-378之间呈正相关，且在预后中等核型分组中 miR-93高表达的频率更低。因此，我们认为miR-93在AML中出现过表达及与 miR-378表达正相关，联合检测miR-93和miR-378的表达有可能作为 AML诊断的参考依据。

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Expression of miR-93 in AML and association between miR-93 and miR-378

TANG Qin1，2，YIN Jia-yu1，ZHU Xiao-wen1，ZHANG Ying-ying1，ZHOU Jing-dong1，DENG Zhao-qun3
（1.Department of Hematology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002；2.Department Of Hematology，the Affiliated Jintan Hospital of Jiangsu University，Jintan Jiangsu 213200；3.Laboratory Centre，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

R733.71

A

1671-7783（2015）01-0068-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140262

国家自然科学基金资助项目（81172595，81270630）；江苏省临床医学科技专项基金资助项目（BL2012056）；江苏省“333工程”科研项目资助计划（BRA2011085，BRA2013136）

汤琴（1972—），女，江苏金坛人，硕士研究生；邓兆群（通讯作者），副教授，硕士生导师，E-mail，dengqian2012@gmail.com

2014-10-10 ［编辑］陈海林