硝基苯胁迫对绿豆种子萌发及根尖细胞死亡的研究*

王晓蕾，刘 聪

(哈尔滨师范大学)

0 引言

硝基苯别名色斑油，作为生产精细化学产品的中间体，是人工合成的化合物.硝基苯类物质主要来源于原油及焦油的提取，广泛应用于石油化工、药物研发、纺织印染等诸多领域.全世界每年排入环境中的硝基苯类化合物约为1万t.硝基苯是高毒性物质，其毒性一般为其他化合物的20～30倍，且具有致突变性，长期接触，对人体及动植物危害极大［1］.

近年来，随着工业的发展，水体环境中硝基芳烃类物质的污染日益严重，已经成为人们关注的焦点问题.国内外对硝基苯类化合物的研究相当活跃，(1)研究了硝基苯的环境行为、生态学特性及在水生生物体内的富集作用及其引起的毒性毒理机制［2－6］;(2)硝基苯对植物的种子萌发、幼苗生长和生理特性的影响进行了报道，研究表明种子的发芽率和幼苗生长受硝基苯影响，硝基苯引起植物细胞遗传损伤，诱导植物细胞坏死及凋亡的产生［7－14］.该文选用绿豆作为实验材料，对硝基苯胁迫下绿豆种子萌发及根尖的损伤及细胞死亡进行研究，为探讨硝基苯的毒性及遗传损伤机理提供一定的参考.

1 材料和方法

1.1 试验材料

材料:绿豆(Phaseolus radiatusL)，购买于哈尔滨市种子公司.

1.2 试验设计

种子萌发试验:选取饱满、大小均匀、色泽一致、无霉变的种子，用浓度为5%的次氯酸钠溶液杀菌10min，用蒸馏水将种子上残留的次氯酸钠溶液冲洗干净.室温条件下将绿豆种子浸泡在水中，使种子吸胀24h.选取吸胀良好、大小一致的绿豆，随机分成6组，每组50粒.取6个大小相同的培养皿，以双层滤纸作为支持物，将绿豆均匀平铺于滤纸表面.25℃恒温培养箱萌发7 d.重复3次.

根尖遗传损伤试验:处理与上面相同，水培法萌发绿豆7 d，绿豆根长为1.5 cm左右.将水培萌发的绿豆根尖插入纱布缝隙中，室温下通风厨内不同浓度的硝基苯染毒处理24h.处理24h后，剪下绿豆根尖放置于－80℃的冰箱中冷冻保存.

1.2.1 硝基苯浓度的设置

浓度为:5，10，25，50，100 mg/L 的硝基苯溶液，同时设置对照处理，对照为水.

1.2.2 测定指标及方法

种子培养期间每天观察并记录发芽及生长情况，计算发芽率、胚芽、胚根长度.

利用CTAB法提取绿豆根尖DNA.DNA琼脂糖凝胶电泳检测根细胞损伤.

1.2.3 数据分析

统计学软件SPSS 17.0对实验组和对照组进行差异显著性分析.

DNA凝胶成相系统观察，并拍照.

2 结果与分析

2.1 硝基苯对绿豆种子萌发率的影响

实验结果见表1，当硝基苯浓度为25 mg/L，绿豆萌发率与对照差异不显著，基本上没有影响.但硝基苯浓度为 50，100，200，300 mg/L 时发芽率 分 别 为 92.78%、85.94%、80.18%、70.67%，与对照差异显著.可见随着硝基苯浓度的升高对绿豆种子萌发抑制作用增加.

表1 不同浓度硝基苯对绿豆种子萌发的影响

2.2 硝基苯对绿豆胚芽、胚根长度的影响

表2 不同浓度硝基苯对绿豆种子胚芽长度的影响

表3 不同浓度硝基苯对绿豆种子胚根长度的影响

实验结果见表2及表3，实验表明，随着硝基苯浓度的增加，绿豆种子的胚芽长度及胚根长度受抑制程度逐渐增大.硝基苯胁迫下的绿豆胚芽长度及胚轴长与对照差异显著.

虽然硝基苯浓度为25 mg/L，绿豆萌发率与对照差异不显著，但它的胚芽长度及胚根长度与对照相比差异显著，会影响绿豆出苗率.

2.3 绿豆根尖细胞基因组DNA的分析

实验结果见图1.电泳结果显示，各硝基苯处理组均出现拖尾带，随着硝基苯浓度的增加，拖尾现象越明显.并没有出现典型DNA梯状条带.植物细胞在应对外界环境的毒素刺激时，有细胞凋亡和细胞坏死两种方式.细胞发生凋亡，会使核酸内切酶激活，基因组的DNA在核小体连接区发生非随机性降解，产生寡核小体片段，其大小相当于核小体(160～200bp)的倍数，在琼脂糖凝胶电泳中可见特征性的“梯”状(ladder pattern)条带.因此可以用琼脂糖凝胶电泳图谱检测细胞凋亡的发生.而当细胞受到外界的刺激而引起细胞坏死时，常由细胞损伤因子引起DNA的无规则断裂，在琼脂糖凝胶电泳图谱上呈现模糊的弥散状条带.该实验中各浓度硝基苯处理组的DNA电泳结果均出现弥散状的拖尾带图，但未见明显的梯形条带，可能是由于弥散带掩盖了梯形条带.即在硝基苯溶液的诱导下，绿豆根尖发生细胞坏死与细胞凋亡共存的情况.

图1 琼脂糖凝胶电泳图谱

3 讨论

徐应明等进行过硝基苯胁迫小麦种子萌发和幼苗生理特性的影响研究，发现在水培条件下，当硝基苯浓度在50 mg·kg－1以上时，小麦种子发芽停止，硝基苯能明显地抑制小麦种子萌发和幼苗的生长，幼苗干重、鲜重存在不同程度的下降，受害程度随硝基苯浓度的增加而加重［10］.刘小民等研究表明:随着硝基苯浓度的增加，绿豆根长、下胚轴长受抑制率逐渐增大.硝基苯胁迫下的绿豆根长、下胚轴长与对照差异显著［11］.这与该实验研究结果相似，硝基苯能明显影响绿豆种子的萌发.

马军、刘宛等研究表明硝基苯能诱发蚕豆根尖细胞较高频率的微核，并能诱发产生染色体断片、染色体桥、染色体滞留等遗传畸变现象［9，12－13］.认为硝基苯对蚕豆细胞具有遗传损伤，可能直接诱发染色体断裂，也可能通过激发细胞内的自由基反应而导致染色体畸变，这些遗传损伤使植物对逆境作出反应，激活其凋亡相关程序，产生PCD(细胞凋亡).该实验的DNA电泳结果表明硝基苯在绿豆种子萌发过程中可引起根尖细胞的死亡，但是细胞坏死与细胞凋亡共存［14］，通过DNA凝胶电泳尚不能确定以哪一种死亡方式为主，需要结合其他实验方法进行判断.

［1］李俊生.硝基苯环境效应的研究综述［J］.生态环境学报，2009，18(1):368－373.

［2］李蕊，冯海涛，郭东林，等.硝基苯诱发大豆根尖细胞遗传畸变研［J］.大豆科学，2008，27(3):95－98.

［3］李宏.饱和对二氯苯液诱导小麦根尖细胞异常性的研究［J］.渝州大学学报:自然科学版，1997，14(1):539–542.

［4］刘宛，宋玉芳，等.氯苯胁迫对小麦种子发芽和幼苗生长的影响［J］.农业环境保护，2001，20(2):25－28.

［5］张芬琴，等.Cd2+胁迫与绿豆幼苗生长及有关生理生化变化［J］.陕西师范大学学报:专辑，2001，29:93－95.

［6］张琼.镉对绿豆幼苗生长的研究［J］.漳州师范学院学报，2007，4(54):106－111.

［7］袁志华，徐应明.灌溉水中苯类物质对农作物毒性效应及污染行为研究［J］.中国农业科学院，2004.

［8］刘天学，等.秸秆焚烧土壤提取液对绿豆种子萌发和幼苗生长的影响［J］.种子，2005，24(4):53－55.

［9］马军，郭长虹.硝基苯对蚕豆的遗传毒性效应分析［J］.自然灾害学报，2008，17(4):95－98.

［10］徐应明，袁志华，等.氯苯－硝基苯胁迫对小麦种子萌发和幼苗生理特性的影响［J］.灌溉排水学报，2004，23(5):6－9.

［11］刘小民.硝基苯胁迫对豆类种子萌发及幼苗生长影响的研究［J］.农业环境科学学报，2007，26(5):1797－1800.

［12］刘宛，周启星，等.1，2，4－三氯苯胁迫对萌发大豆种子中活性氧的影响［J］.应用生态学报，2002，13(12):1655－1658.

［13］刘宛，周启星，等.氯苯胁迫对蚕豆幼苗生长和细胞分裂的影响［J］.应用生态学报，2003，14(4):585－588.

［14］张跃华，冉超，商艳艳，等.硝基苯对蚕豆根尖细胞凋亡的研究［J］.生物学通报，2007，42(1):47－48.