红景天总黄酮对大鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用

安　英，路　倩，徐丛飞，王艳春，韩丽琴

(1.吉林医药学院基础医学院机能实验室，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院基础医学院药理学教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林医药学院药学院化学教研室，吉林 吉林 132013)

红景天总黄酮对大鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用

安英1，路倩2，徐丛飞3，王艳春2，韩丽琴3

(1.吉林医药学院基础医学院机能实验室，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院基础医学院药理学教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林医药学院药学院化学教研室，吉林 吉林 132013)

目的：研究红景天总黄酮对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞(CFB)增殖的抑制作用，探讨红景天总黄酮改善心肌纤维化的作用机制。方法：采用TGF-β1(5 μg·L-1)诱导大鼠CFB增殖，构建心肌纤维化细胞模型。将正常培养的大鼠CFB分为对照组、模型组和25、50及100 mg·L-1红景天总黄酮组。给药48 h后，MTT法检测细胞活力，ELISA法检测细胞培养上清液中Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅲ)的水平，检测上清液中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的水平。结果：MTT法检测，与对照组比较，模型组细胞活力明显升高(P<0.01)；与模型组，红景天总黄酮各剂量组细胞活力均明显下降(P<0.05)。T-SOD和MDA检测，与对照组比较，模型组细胞T-SOD活性下降(P<0.05)，MDA水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，50和100 mg·L-1组细胞T-SOD活性明显升高(P<0.01)，25和50 mg·L-1红景天总黄酮组MDA水平明显下降(P<0.05)。GSH-Px和GSH检测，与对照组比较，模型组细胞GSH-Px活性及GSH水平均明显降低(P<0.01)；与模型组比较，红景天总黄酮各剂量组细胞GSH-Px活性和GSH水平均升高(P<0.05)。ColⅠ和Col Ⅲ水平测定，模型组ColⅠ和Col Ⅲ水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，红景天总黄酮各剂量组细胞2种蛋白水平均明显下降(P<0.05)。结论：红景天总黄酮可以抑制大鼠CFB的增殖，并可能经抗氧化应激途径改善心肌纤维化。

红景天总黄酮；心肌纤维化；心肌成纤维细胞；转化生长因子β1

红景天(Rhodiola rosea)是景天科植物，其根、茎均可入药，被誉为“高原人参”和“雪山仙草”。国内外学者对红景天属植物化学成分黄酮类进行了大量研究，其主要成分包括黄酮醇及其苷类化合物[1]。红景天属植物具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳与增强免疫力、抗肿瘤、抗缺氧及改善心血管系统功能等药理作用[2]。有关红景天黄酮体外抗氧化活性研究[3]发现：其对羟自由基、超氧阴离子自由基和1，1-二苯基-2-苦基肼(1，1-Dipheny1-2-picryl-hydrazyl,DPPH)自由基的清除呈浓度依赖性。红景天总黄酮是否通过抗氧化途径改善心肌纤维化，尚未见相关报道。本研究采用转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)诱导心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFB)增殖，观察红景天总黄酮是否通过抗氧化途径改善心肌纤维化，探讨红景天总黄酮治疗心肌纤维化的可能性及相关机制。

1　材料与方法

1.1实验动物、药品、主要试剂和仪器Wistar大鼠10只，清洁级，1～3 d龄，雌雄兼用，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(吉)2007-0003。红景天总黄酮(吉林医药学院药学院研究室提供)，改良型RPMI-1640培养基(赛默飞世尔生物化学制品)，胎牛血清(浙江天航生物科技公司)，TGF-β1(深圳百恩维生物有限公司)，胰蛋白酶、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，Ⅰ型胶原(collagen proteinⅠ,ColⅠ)和Ⅲ型胶原(collagen protein Ⅲ,Col Ⅲ)ELISA检测试剂盒(上海卡努生物科技有限公司)，总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。DL-CJ-1N超净工作台由北京东联哈尔仪器制造有限公司生产，Ti-S倒置显微镜由日本尼康公司生产，MCO-18AZX CO2培养箱由日本Sanyo公司生产，WD-2102A自动酶标仪由北京市六一仪器厂生产。

1.2CFB的分离与培养取Wistar大鼠，无菌开胸取心肌，用PBS缓冲液清洗，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片，0.125%胰蛋白酶反复消化，收集各次消化上清液，离心(1 000 r·min-1，5 min)，弃上清，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，制成细胞悬液，接种于培养瓶中，置37℃、5% CO2培养箱内培养。用差速贴壁法去除内皮细胞及心肌细胞，实验采用第2代培养细胞。

1.3实验分组和给药大鼠CFB分为5组。正常对照组：培养细胞中加入PBS缓冲液；模型组：培养细胞中加入TGF-β1(终浓度5 μg·L-1)，刺激CFB增殖；低剂量红景天总黄酮组：加入TGF-β1(终浓度5 μg·L-1)和25 mg·L-1红景天总黄酮；中剂量红景天总黄酮组：加入TGF-β1(终浓度5 μg·L-1)和50 mg·L-1红景天总黄酮；高剂量红景天总黄酮组：加入TGF-β1(5 μg·L-1)和100 mg·L-1红景天总黄酮。

1.4MTT法检测细胞活力大鼠CFB消化后，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释细胞悬液，计数后以每毫升5×104个细胞、每孔100 μL接种于96孔板上。将细胞分5组，每组设5个复孔，除正常对照组加PBS缓冲液外，其余各组均每孔加TGF-β1(终浓度5 μg·L-1)，置于37℃、5%CO2培养箱孵育24 h后，吸除上清液。按上述分组加培养基和不同终浓度的红景天总黄酮，48 h后收集上清液，每孔加入150 μL RPMI-1640培养液及20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，37℃、5%CO2条件下继续孵育4 h。取出后终止培养，吸除孔内上清液，每孔加150 μL DMSO，低速震荡10 min，使结晶物充分溶解。采用酶标仪在波长490 nm处测定各组吸光度(A)值。

1.5比色法测定T-SOD、GSH-Px活性和MDA、GSH水平试剂盒分别测定各组细胞培养上清中T-SOD、MDA、GSH-Px和GSH的浓度，各项检测均按照试剂盒说明书操作。

1.6ELISA法检测ColⅠ和Col Ⅲ水平ELISA法分别检测细胞上清液中ColⅠ和Col Ⅲ水平，严格按试剂盒操作说明书进行。大鼠CFB上清液3 000 r·min-1离心10 min，取上清，根据预实验对样品5倍稀释。标准品用标准稀释液依次稀释成3.12、6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μg·L-1的不同浓度。每组设5个复孔，各孔分别加入酶标二抗100 μL(空白孔不加)，37℃恒温箱温育1 h，反复洗涤后，各孔分别加入底物A和B各50 μL，37℃避光孵育15 min，各孔加入终止液50 μL，酶标仪检测450 nm处各孔的A值，绘制标准曲线，计算各组上清液中ColⅠ和ColⅢ水平。

2　结　果

2.1MTT比色法检测CFB活力与对照组(0.44 ±0.06)比较，模型组CFB活力(0.63±0.10)明显升高(P<0.01)；与模型组比较，25、50和 100 mg·L-1红景天总黄酮组CFB活力(0.50 ±0.10、0.48 ±0.11和0.44 ±0.06)明显降低(P<0.05或P<0.01)。

2.2细胞培养上清液中MDA水平和T-SOD活性与对照组比较，模型组细胞培养上清液中T-SOD活力下降(P<0.05)，而MDA水平明显升高(P<0.05)；经红景天总黄酮处理48 h后，与模型组比较，25 mg·L-1红景天总黄酮组细胞培养上清液中T-SOD活性无明显变化(P>0.05)，而50和100 mg·L-1红景天总黄酮组细胞培养上清液中T-SOD活性明显升高(P<0.01)；与模型组比较，25 和50 mg·L-1红景天总黄酮组细胞培养上清液中MDA水平明显下降(P<0.05)，而100 mg·L-1红景天总黄酮组无明显变化(P>0.05)。见表1。

表1各组细胞上清液中MDA水平和T-SOD活性

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

2.3细胞培养上清液中GSH水平和GSH-Px活性与对照组比较，模型组细胞培养上清液中GSH-Px活性和GSH水平明显下降(P<0.01)；经红景天总黄酮处理48 h后，与模型组比较，各剂量红景天总黄酮组细胞培养上清液中GSH-Px活性和GSH水平均升高(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2各组细胞上清液中GSH水平和GSH-Px活性

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

2.4细胞培养上清液中ColⅠ和Col Ⅲ水平ELISA检测结果显示：TGF-β1作用于CFB后，模型组细胞培养上清液中ColⅠ和Col Ⅲ水平较对照组明显升高(P<0.01);经红景天总黄酮处理48 h后，与模型组比较，红景天总黄酮各剂量组细胞培养上清液中ColⅠ和Col Ⅲ水平均明显下降(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3各组细胞上清液中ColⅠ和ColⅢ水平

Tab.3Levels of ColⅠand Col Ⅲ in supernatant of cells in various groups

GroupColⅠColⅢControl4.79±1.576.15±0.58Model11.52±1.17**9.14±1.40**Rhodiolatotalflawonoids(mg·L-1) 259.17±1.15△7.09±0.69△ 507.22±0.86△△6.86±0.80△ 1006.25±1.14△△6.41±0.25△△

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

3　讨　论

心肌纤维化是由于CFB增殖或活化，心肌组织中胶原纤维的过量沉积使心室壁僵硬、顺应性降低，从而影响心肌收缩和舒张功能，最终导致心脏功能障碍和心力衰竭[4]。心肌纤维化的病因仍未明确，可能与氧化应激、炎症因子和生长因子等因素激活或失调有关[5-7]。TGF-β1是成纤维细胞的强趋化因子，可调节成纤维细胞的增殖、迁移及细胞外基质的产生[8]。TGF-β1可诱导成纤维细胞分化为CFB，进而刺激胶原蛋白、纤维连接蛋白及蛋白多糖等间质成分的合成，促进细胞间质的沉积，最终导致心肌纤维化发生[9]。本研究结果表明：TGF-β1可显著促进大鼠CFB的增殖，并诱导胶原蛋白合成增加。红景天总黄酮是从红景天中提取的有效成分(主要有黄酮醇及其苷类化合物)，其具有广泛的抗氧化、抗衰老、抗肿瘤和改善心血管系统功能等生理活性[10-11]。本研究结果表明：红景天总黄酮处理CFB后，在25～100 mg·L-1浓度范围内，可抑制CFB增殖，且具有一定的剂量依赖性。

氧化应激在多种疾病导致的纤维化中发挥重要的作用，研究[12-13]表明：心肌组织氧化应激过度，会刺激胶原纤维合成增加，从而导致心肌纤维化。SOD活性的高低间接反映机体清除氧自由基水平，其能催化生物氧化而产生的超氧阴离子自由基O2-，生成H2O2，通过GSH-Px作用分解成H2O和O2，从而保护细胞免受损伤[14]。MDA可反映机体内自由基的浓度和脂质过氧化的程度，其高低可间接反映细胞受自由基损伤的严重程度[15]。GSH是衡量细胞抗氧化能力的重要因素，能够清除自由基并且保护含巯基的酶，避免红细胞蛋白及其他辅助因子受到氧化损伤作用[16-17]。本实验检测细胞培养上清液中T-SOD、GSH-Px活性和GSH、MDA水平发现：红景天总黄酮各剂量组中T-SOD和GSH-Px活性升高，GSH水平提高，而MDA水平(100 mg·L-1组除外)下降，提示红景天总黄酮可能是通过降低细胞内氧化应激水平，改善心肌纤维化，但其具体的作用机制仍有待于进一步研究。

心肌胶原中，以Col Ⅰ型和ColⅢ为主，ELISA检测结果显示：模型组中ColⅠ和ColⅢ均明显上调，提示TGF-β1通过增加成纤维细胞ColⅠ和Col Ⅲ的分泌，使间质细胞外基质的合成与降解失衡，从而促进心肌纤维化的发生发展。不同剂量红景天总黄酮均能明显抑制体外培养的大鼠CFB合成与分泌ColⅠ和 ColⅢ，且具有一定的剂量依赖性关系。

综上所述，本研究初步探讨了红景天总黄酮对心肌纤维化的防治作用及其机制，推测红景天总黄酮除具有抗衰老、抗肿瘤和改善心血管系统功能等作用外，还可作为防治心肌纤维化的药物，为红景天总黄酮的临床应用提供了新的领域。

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Inhibitory effect of Rhodiola total flavonoids on proliferation of cardiac fibroblasts in rats

AN Ying1,LU Qian2,XU Congfei3,WANG Yanchun2,HAN Liqin3

(1.Medical Functional Laboratory,School of Basic Medical Sciences, Jilin Medical University,Jilin 132013,China；2. Department of Pharmacology,School of Basic Medical Sciences, Jilin Medical University,Jilin 132013,China；3. Department of Chemistry,School of Pharmacy,Jilin Medical University，Jilin 132013,China)

Objective To investigate the inhibitory effect of Rhodiola total flavonoids on transforming growth factor (TGF) -β1-induced proliferation of cardiac fibroblasts (CFB) in the rats,and to explore its mechanisms of improving myocardial fibrosis.Methods5 μg·L-1TGF-β1 was used to induce the proliferation of CFB to build the cell models of myocardial fibrosis.The cultured CFB were divided into control group,model group,and low,medium,high doses(25,50 and 100 mg·L-1) of Rhodiola total flavonoids groups.The cells were treated for 48 h,the vitalities of cells were detected by MTT, the levels of collagen proteinⅠ (ColⅠ) and collagen proteinⅢ (Col Ⅲ) in supernatant were measured by ELISA,and the activities of total superoxide dismutase (T-SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were detected, the levels of malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) were also measured.Results The MTT results indicated that compared with control group,the cell vitality in model group was significantly increased (P<0.01). compared with model group, the cell vitalities of CFB in Rhodiola total flavonoids groups were significantly decreased (P<0.05).Compared with control group,the T-SOD activity in model group was decreased,while the MDA level was significantly increased (P<0.05); compared with model group,the T-SOD activities in 50 and 100 mg·L-1Rhodiola total flavonoids groups were increased (P<0.01); the MDA levels in 25 and 50 mg·L-1groups were decreased significantly (P<0.05).Compared with control group,the GSH-Px activity and GSH level in model group were significantly decreased (P<0.01). Compared with model group, the GSH-Px activities and GSH levels in Rhodiola total flavonoids groups were increased (P<0.05).Compared with control group, the ColⅠand Col Ⅲ levels in model group were significantly increased (P<0.01); compared with model group, the ColⅠand Col Ⅲ levels in Rhodiola total flavonoids groups were significantly decreased (P<0.05).ConclusionRhodiola total flavonoids can inhibit the proliferation of rat CFB.The development of myocardial fibrosis may be inhibited by Rhodiola total flavonoids through anti-oxidative stress pathway.

Rhodiola total flavonoids; myocardial fibrosis; cardiac fibroblasts; transforming growth factor β1

1671-587Ⅹ(2015)06-1190-05

10.13481/j.1671-587x.20150618

2015-03-03

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究基金资助课题(2013476)

安英(1979-)，女，吉林省延吉市人，讲师，医学硕士，主要从事心血管药理学方面的研究。

韩丽琴，教授(Tel：0432-64560536，E-mail：786533955@qq.com)

R285.5

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