基于硼酸酯黄酮苷分子印迹聚合物的制备及识别性能研究

张亚楠，陈剑松，黎惠柔，何建峰（广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006）

科技与应用

基于硼酸酯黄酮苷分子印迹聚合物的制备及识别性能研究

张亚楠，陈剑松，黎惠柔，何建峰*
（广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006）

分别以芦丁和柚皮苷为模板分子，4-乙烯基苯硼酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，1，4-二氧六烷为致孔剂，偶氮二异丁腈为引发剂，采用可逆共价结合方式制备出两种基于硼酸酯结合的分子印迹聚合物，并对它们的吸附介质、结合动力学速率、专一识别性和交叉选择性进行了研究。结果表明，可逆共价印迹聚合物适用于水相介质，在3 h内可以达到吸附平衡。选择性结合实验表明该两种MIP具有良好的分离选择性，其对各自的模板分子均表现最大的吸附量，而对其结构类似物吸附较少。

芦丁；柚皮苷；分子印迹聚合物；硼酸酯

分子印迹是制备针对特定模板具有特异识别能力聚合物的技术，采用该技术制备的分子印迹聚合物（MIP）目前已广泛应用于固相萃取［1］、色谱分离［2］、化学传感器［3］和药物载体［4］等领域。传统的MIP一般采用非共价印迹方法制备，一般在弱极性有机溶剂中使用，不适用于强极性有机溶剂和水相，因而限制了它的应用。黄酮苷类化合物是中草药中重要的活性成分，在医药中有许多重要的应用，但黄酮苷化合物种类繁多，结构相似，使得其分离较为困难。本研究以黄酮苷类化合物芦丁和柚皮苷为印迹分子，4-乙烯基苯硼酸为功能单体，采用可逆共价结合方式制备出两种基于硼酸酯结合的新型MIP，并对它们的吸附介质、结合动力学速率和专一选择性进行了探讨，该研究对于开发应用黄酮苷类化合物的分离固相材料具有重要的现实意义。

1　实验材料与方法

1.1实验材料

柚皮苷、芦丁（98%，南京泽朗医药科技有限公司）；4-乙烯基苯硼酸（80%，阿法埃莎（天津）化学有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，98%，上海阿拉丁试剂有限公司，使用前经过减压蒸馏以除去阻聚剂）；偶氮二异丁腈（AIBN，化学纯，广州化学试剂厂，使用前重结晶）；1，4-二氧六烷（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；分子筛（AR，分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；

UV-1000紫外分光光度计（上海天美科技有限公司）；KQ-50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1芦丁、柚皮苷分子印迹聚合物的制备

称取芦丁0.061 2 g，4-乙烯基苯硼酸0.029 2 g，溶于15 mL 1，4-二氧六烷中，滴加2滴浓硫酸，于94℃回流反应1 h，得预聚体。将预聚体置于15 mL试管中，依次加入EDMA 0.091 0g，AIBN 0.011 0g，通氮气10 min，将试管密封，并置于65℃水浴中反应36 h，得到白色块状聚合物。将聚合物研磨，过120目筛，获得的聚合物微粒用20 mL甲醇-水（v/v，7∶3）在40℃下搅拌回流，每5 h更换一次溶剂，直至水解液经紫外检测无模板分子吸收为止，最后用甲醇将聚合物洗至中性。将制备的分子印迹聚合物在60℃下真空干燥24 h，备用。柚皮苷MIP制备时模板分子使用量为0.058 g，其它试剂用量与制备方法与芦丁相同。

柚皮苷、芦丁空白聚合物（NIP）的制备方法同上，但不加模板分子。

1.2.2印迹聚合物的底物选择性研究

称取10 mg芦丁、柚皮苷的MIP/NIP置于锥形瓶中，分别加入2 mL 2 mmol/L各底物（芦丁、柚皮苷、槲皮素）的甲醇-磷酸缓冲液（v/v，7∶3，pH= 8），于室温下搅拌24 h，用0.22μm微孔滤膜过滤，用紫外-可见光谱分析滤液中待测物的浓度，并计算出聚合物对模板分子的吸附量Q（μmol/g）。

1.2.3柚皮苷MIP的吸附动力学研究

称取10mg柚皮苷MIP置于锥形瓶中，分别加入2mL 2mmol/L柚皮苷的甲醇-磷酸缓冲液（v/v，7∶3， pH=8），于室温下搅拌，分别于0.5 h、2 h、3 h、5 h、6 h、10 h取滤液进行紫外光谱分析，检测滤液中柚皮苷的浓度，并计算出聚合物对模板分子的吸附量Q（μmol/g）。

2　结果与讨论

2.1聚合物的制备

图1出示了柚皮苷分子印迹聚合物的制备示意图。本研究根据柚皮苷、芦丁糖单元含顺式二醇的结构特点，选用4-乙烯基苯硼酸为功能单体，通过加热回流反应先使其与顺式二醇形成环状硼酸酯预聚体，然后再将预聚体通过交联剂引发聚合形成高度交联的高分子聚合物，用甲醇-稀盐酸水解功能单体与模板分子形成的硼酸酯键，这样在聚合物母体中得到分子印迹孔穴，此孔穴形状与模板分子匹配，孔穴周围的硼酸基能与模板分子可再次形成硼酸酯键，因而其对模板分子具有高度的识别能力。

图1　柚皮苷可逆共价分子印迹聚合物制备示意图

2.2吸附介质的优化

吸附介质是影响MIP吸附性能的一个重要指标。研究表明，以纯有机溶剂甲醇和1，4-二氧六烷为吸附介质，当柚皮苷浓度为2 mmol/l时，MIP对模板分子的吸附量分别为6.71 μmol/g和17.00 μmol/g。而以甲醇-磷酸缓冲液（pH=7.0）（v/v，7∶3）作为吸附介质时，吸附量明显提高，可达34.80 μmol/g，表现出比单纯有机介质更好的吸附性。由于碱性条件更有利于硼酸酯键的形成［5］，故在该研究中，对MIP在不同pH值下的甲醇-磷酸缓冲液（v/v，7∶3）中的吸附效果进行了进一步的探讨。结果如图2所示。由图2可见，随着吸附介质pH值增大，MIP和NIP的吸附量逐渐增多，但NIP的增加量明显比MIP要少，说明pH值的升高对于特异性吸附影响较大。当pH=8.0时，MIP和NIP吸附量分别达到64.8 μmol/g 和29.03 μmol/g，此时MIP吸附量较高，且MIP和NIP差异也相对最大，再增大吸附介质的pH值实验发现此时柚皮苷不能完全溶解，因此本研究选取甲醇-磷酸缓冲液（pH=8.0）（v/v，7∶3）作为最佳的吸附介质。

图2　柚皮苷MIP/NIP在不同pH值条件下的吸附量

2.3柚皮苷的吸附动力学研究

MIP对印迹分子的吸附平衡时间影响其色谱分离行为，为了研究MIP对模板分子的结合速率，本实验通过用2 mmol/l的柚皮苷标准液的的甲醇-磷酸缓冲液 （v/v，7∶3）为吸附介质，测定了MIP在pH8.0磷酸盐缓冲液中对模板分子的吸附动力学行为。由图3可见，在pH 8.0时，MIP对模板分子的结合是较快的，其吸附量在60 min时可达到最大结合容量的63%，在3小时之内可达到吸附平衡，这与非共价印迹聚合物的结合速率基本相似［6-7］。

图3　柚皮苷MIP的动力学吸附曲线

2.4印迹聚合物对底物的结合选择性

聚合物对底物的结合分配系数可描述为Kd=CP/CS，式中CP（μmol/g）为底物在聚合物上的结合量；CS（mmol/l）为平衡吸附液中底物的浓度。Kd值越高，表示聚合物对该底物的结合量越大［8］。分别选取化合物芦丁、柚皮苷和槲皮素作为聚合物底物，对其选择性进行探讨，结果如表1、表2所示。

从表1、表2可以看出，芦丁MIP对芦丁的Kd值明显比对柚皮苷和槲皮素要高，而柚皮苷MIP对柚皮苷的Kd值则明显比槲皮素和芦丁要高，而NIP对三种底物的吸附均比MIP低。这表明MIP对模板分子具有明显的专一识别能力和高度选择性。据此可推测印迹聚合物中产生了具有特异识别的分子印迹孔穴，虽然槲皮素和芦丁含有邻二醇结构，可以形成硼酸酯，但是由于它们的分子形状与模板分子差异较大，故其不能进入分子印迹孔穴与硼酸基团产生共价作用，因而柚皮苷MIP对底物槲皮素和芦丁吸附均较少。

表1 芦丁MIP/NIP 对各底物的Kd值

表2　柚皮苷MIP/NIP对各底物的Kd值

3　结论

本研究以芦丁和柚皮苷为模板分子，4-乙烯基苯硼酸作为功能单体，采用可逆共价的结合方式分别制备芦丁和柚皮苷分子印迹聚合物。研究结果表明，基于硼酸酯可逆共价结合的MIP具有在碱性水溶液中对模板分子相对较快的吸附动力学以及较高的专一识别性能。作为固相萃取的新型吸附剂材料，该MIP显示了良好的分离能力和在水相环境中的良好适应能力，故在中药有效成分黄酮苷类化合物的分离纯化方面具有良好的应用前景。

［1］HU X G，HU Y L，LI G K.Development of novel molecularly imprinted solid-phase microextraction fiber and its application for the determination of triazines in complicated samples coupled with high-performance liquid chroma-tography［J］.J.Chromatogr.A，2007，1147（1）：1-9.

［2］XIE J C，XU X J，et al.Direct extraction of specific pharmacophoric flavonoids from gingko leaves using a molecularly imprinted polymer for quercetin［J］.J.Chromatogr. A，2011，934（1/2）：1-11.

［3］衣丽娜，尹小英，江一帆，等.分子印迹技术高效分离中药活性成分的应用［J］.国际药学研究杂志，2012，39 （4）：307-310.

［4］孔丹凤，赵雯，卢婷利，等.分子印迹技术在药物分离中的研究进展［J］.药学实践杂志，2011，29（3）：161-164.

［5］姜忠义.分子印迹聚合物的设计与制备［J］.高分子材料科学与工程，2004，20（3）：25-28.

［6］XU l，XU Z F.Molecularly imprinted polymer based on multiwalled carbon nanotubes for ribavirin recognition ［J］.J.Polym.Res.，2012，19（8）：9942.

［7］徐莉，何健峰.亲水性分子印迹纳米球的合成及药物识别与释放性能研究［J］.中山大学学报：自然科学版，2010，49（3）：61-64.

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［责任编辑：吴卓］

The Preparation of Flavonoid Glycoside Molecularly Imprinted Polymer Based on Borate Ester and Its Recognition Properties

ZHANG Yanan，CHEN Jiansong，LI Huirou，HE Jianfeng*
（School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong 510006，China）

In this study，two kinds of molecularly imprinted polymers based on borate ester were prepared by using rutin and naringin as template molecules，4-vinyl phenylboronic acid as functional monomer，two glycol methacrylate as cross-linking agent，1，4-dioxane as a porogenic agent，AIBN as initiator，respectively.The adsorption medium，binding kinetics，specific recognition and cross-selectivity of the imprinted polymers were studied.The results showed that the reversible covalent imprinted polymers were suitable for using in aqueous media，and it could reach the adsorption equilibrium in the 3 hours.The selective experiment indicated that both polymers showed the maximum adsorption for template molecule，while less for its analogues，which showed a good separative ability and selectivity.

rutin；naringin；molecularly imprinted polymer；borate ester

O631.3

A

1672-6138（2015）03-0007-04

10.3969/j.issn.1672-6138.2015.03.002

2015-06-09

广东高校优秀青年创新人才培养项目（K5090006）。

张亚楠（1993—），女，河南许昌人，广州中医药大学硕士研究生，研究方向：高分子功能材料。