镓卟啉配合物的光动力抗肿瘤活性研究

汪华华，谢安娜，王湘利，张召，刘海洋（华南理工大学化学系，广州 510640）

镓卟啉配合物的光动力抗肿瘤活性研究

汪华华，谢安娜，王湘利，张召，刘海洋⋆
（华南理工大学化学系，广州 510640）

以5,10,15,20-四（乙氧基羰基）卟啉和GaCl3为原料合成了5,10,15,20-四（乙氧基羰基）卟啉镓（GaTECP）配合物，并对其进行了紫外可见光谱，高分辨质谱和核磁共振谱表征。利用M TT法研究了GaTECP对人肺腺癌细胞A549、子宫颈癌细胞H ela和人肝癌细胞H ep G2的细胞毒性，发现其在暗条件下几乎没有细胞毒性，但在光照条件下显示较强的细胞毒性。此外，还进一步研究了GaTECP在A549细胞内的定位及其对细胞形态的影响，并测定了活性氧物种和线粒体膜电位的变化。结果显示被细胞吸收的GaTECP主要定位在A549的线粒体上，光辐照后能产生活性氧物种和降低线粒体的膜电位，最终导致细胞凋亡。

卟啉；镓；抗肿瘤活性；细胞毒性；光动力治疗

引言

光动力疗法（PDT）是目前肿瘤治疗中比较被人们所认可的一种手段。与传统的抗癌治疗相比较，PDT有几个优点，如治疗位置和治疗时间的控制以及重复使用药物剂量的可能性［1］。在PDT中，三个无毒成分（光敏剂，光和分子氧）仅在肿瘤组织中联合产生活性氧物种（ROS），尤其是单线态氧。因此，光动力疗法与传统的癌症治疗方法有很大的不同，如放疗、手术或化疗，可以提高患者的生活质量。然而，光动力疗法是目前肿瘤治疗由于光敏剂的低效率而受到限制，因此需要开发新型高效的光敏剂。为了增加光敏剂效果，以下的药理作用和光化学效率有待提高［2］：1）根据肿瘤的吸收效率，细胞摄取效率和从正常组织中清除效率等提高肿瘤的选择性积累效率；2）从红光到近红外区域强的光吸收效率；3）单线态氧等活性氧物种的量子产率要高。

卟啉及其金属配合物是稳定的天然功能性染料，其具有大的可见光消光系数、刚性结构和有效的光化学电子转移能力，已被广泛的用于各种光捕获和光电器件材料研究［3］。卟啉及其金属配合物作为光动力治疗中的光敏剂分子，能够有效的把光能转化成化学能，传递能量给分子氧从而生成具有高活性的单线态氧［4］。此外卟啉类化合物易于在肿瘤部位富集，这是抗肿瘤药物非常重要的特性［5-7］。

我们最近报道了中位乙氧基羰基取代的卟啉相对于其他芳基取代的卟啉具有更好的平面结构［8］。目前对该类金属卟林啉配合物基础性质研究并不多。本文合成了这一卟林家族一个新的镓配合物5，10，15，20-四（乙氧基羰基）卟啉镓（GaTECP），研究了它对多株人肿瘤细胞的光毒性。结果表明该配合物对A549癌细胞有很好的光动力治疗效果，是一种潜在的抗肿瘤药物。在光照条件下，GaTECP能够提高肿瘤细胞内活性氧物种的生成，减低线粒体的膜电位，通过氧化损伤诱导癌细胞凋亡。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

日本岛津Shimadzu UV-2450 （PC）型紫外可见分光光度计；日本HITACHI F-4500荧光光谱仪；德国布鲁克Avance III 400 MHz核磁共振仪；德国卡尔蔡司Axio Observer Z1荧光显微镜；美国伯腾ELx808吸收光酶标仪。96孔培养板（海门市博阳实验器材厂）；TDL-50B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）； pH计（PB-10）；10L-lS电热恒温鼓风干燥箱（天津市华美实验仪器有限公司）；YX280B高压灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）；Advantage A10 Milli-Q纯水仪（MILLIPORE 公司）；YT-CJ-IND 型洁净工作台（苏州净化有限公司）；AL104-6020电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；HFI 60w水套式二氧化碳细胞培养箱（上海力申科学仪器有限公司）。

MTT（美国Sigma公司）；实验细胞选A549人肺腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞、Hep G2人肝癌细胞，均由ATCC（American Type Culture Collection）公司提供；Tissue Culture Dishes培养皿（Greiner bio-one公司）；胎牛血清（上海雅吉生物科技有限公司）；DMEM 培养基（GIBCO公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT，Amresco公司）；0.25% Trypsin-0.01% EDTA（自己配制）；二甲基亚砜（Sigma公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（自己配制）；灭菌生理盐水（自己配制）。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 镓卟啉的合成

5，10，15，20-四（乙氧基羰基）卟啉（TECP按参考文献方法合成［8］。

在100mL的圆底烧瓶中加入60mg的TECP和20倍当量的GaCl3（352mg），然后加入20mL吡啶作为溶剂，搅拌回流6h，用紫外监测直到反应完全，冷却至室温。将反应液通过旋转蒸发仪除去吡啶溶剂，得到粗产品。用100-200目硅胶柱分离纯化，以二氯甲烷和甲醇（VDCM∶VMeOH=97∶3）的混合溶液作为淋洗剂，最终得到紫色的固体。产率70%。Uv-Vis （DMSO） λmax（ε， ［103 M-1-cm-1］）: 413 （283.45）546 （13.80） 583 （4.53）；HR-MS C32H28GaN4O8［M-Cl］+实际值：665.115 5，理论值：665.115 7；1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ 9.64 （s， 8H）， 5.04 （s， 8H）， 1.79 （s， 12H）。

1.3 MTT细胞活性实验

测试指数生长期的肿瘤细胞，弃去培养基，用PBS洗涤2～3次，然后用1mL胰酶消化为悬液，细胞计数后加入培养基稀释细胞浓度到1.5×104个/ mL，接种到96孔培养板中，每孔加200μL，细胞数约为5×103个。每组设6个复孔，重复3次。在37℃、5%的二氧化碳饱和湿度培养箱中孵育24h，细胞贴壁后，吸去上清液，加入新的DMEM培养基，同时加入GaTECP，每孔总体积200μL。继续培养2h后，距离培养皿15.5cm处用625nm波长的灯光照1h，继续培养21h。然后每孔加入20μL的MTT（5mg/mL），37℃继续培养4h，弃去上层清液每孔加入100μL 的DMSO，振荡使甲攒结晶完全溶解后，测定波长在570nm下各孔的吸光度值。在无光照条件下重复实验作为暗对照。按照如下公式计算细胞生长活力：

细胞存活率%=实验组A490/对照组A490×100%

根据所测得的各细胞存活率，计算软件计算目标化合物对肿瘤的半数抑制浓度（IC50）值。

1.4 细胞定位实验

生长对数期的A549细胞与GaTECP在37℃、5%的二氧化碳饱和湿度培养箱中孵育12h。然后细胞用PBS洗涤三次，加入1mL细胞固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）于室温下固定细胞，20min后用PBS缓冲液洗涤，在黑暗环境进行Hoechst 33342 （5μg/mL）和R123（5μM）染色30min，弃去染色液，PBS缓冲液洗涤2～3次后，荧光显微镜拍照。

1.5 细胞核形态变化

取生长对数期的A549细胞与GaTECP首先在37°C、5%的二氧化碳饱和湿度培养箱中孵育2h，距离培养皿15.5cm处用625nm波长的灯光照1h，放入培养箱中继续培养21h后待测。将待测细胞取出用PBS缓冲液洗涤三次，加入1mL细胞固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）于室温下固定细胞，20min后用PBS缓冲液洗涤，在黑暗环境进行Hoechst 33342 （5μg/mL）染色3～5min，弃去染色液，PBS缓冲液洗涤2～3次后，荧光显微镜拍照，观察目标化合物处理肿瘤细胞核的状态变化。分别在无光照、光照不加药和暗光加药条件下重复实验作为对照组。

1.6 细胞内活性氧测定

取生长对数期的A549细胞接种到6孔板中，在37°C、5%的二氧化碳饱和湿度培养箱中孵育24h。待细胞贴壁后，吸去上清液，加入新鲜的DMEM培养基，同时加入化合物GaTECP，每孔总体积为200μL。将药物处理过的A549细胞放入上述培养箱中培养2h后，距离培养皿15.5cm处用625nm波长的灯光照射1h，继续放入培养箱培养21h待测。将待测细胞取出至于黑暗环境中，每孔加入H2DCF-DA （10mM）染色20min，用PBS-EDTA缓冲液洗涤两次，用荧光显微镜拍照。分别在无光照、光照不加药和暗光加药条件下重复实验作为对照组。

1.7 线粒体膜电位的测定

将生长对数期的A549细胞接种到6孔板中，在37°C、5%的二氧化碳饱和湿度培养箱中孵育24h。细胞贴壁后，吸去上清液，加入新的DMEM培养基，同时加入化合物GaTECP，每孔总体积200μL。将6孔板放回培养箱中培养2h后，距离培养皿15.5cm处用625nm波长的灯光照1h，放入上述培养箱中继续培养21h后待测。然后在黑暗中每孔加入JC-1染液（1mL）染色20min后，用JC-1缓冲液洗涤两次，用荧光显微镜拍照。分别在无光照、光照不加药和暗光加药条件下重复实验作为对照组。

2 结果与讨论

2.1 GaTECP的抗肿瘤活性

表1 GaTECP对不同肿瘤细胞株增殖抑制的影响

表1列出了GaTECP对3种肿瘤细胞株的细胞毒性试验结果。在暗条件下它的细胞毒性很小，但是在红光光照的条件下对三种肿瘤细胞都具有很好的细胞毒性。尤其是对A549细胞的半抑制浓度能够降低到3.2μM，说明GaTECP是一种潜在的光动力治疗药物。

图1 GaTECP在A549细胞内定位。（a：细胞核染色；

图2 GaTECP对A549细胞形态的变化。

2.2 GaTECP在A549细胞内定位

化合物与乳腺癌细胞A549共培养24h后加细胞固定液，经Hoechst 33342和R123染色，在荧光显微镜下可以观察到细胞核为蓝色，线粒体为绿色。如图1中a和b所示。

从图中可以看出，GaTECP能够进入细胞，并且在细胞内显示红色荧光，红色荧光的区域与细胞中线粒体染色后的绿色荧光区域相吻合。由此可以说明GaTECP能够进入细胞并且定位在线粒体中。

2.3 GaTECP对A549细胞形态的影响

图3 GaTECP对A549细胞核形态的变化。

抗肿瘤药物与癌细胞作用后会导致细胞的形态发生变化，细胞形态由舒展的柳叶状通过皱缩现象，最终变成圆形颗粒态。我们分别通过暗对照、光照对照、暗光不加药对照和光照加药实验来考察GaTECP在光照条件下对A549细胞的形态影响。在明场下观察细胞形态（见图2），三个对照实验中细胞的形态并没有很明显的变化，但是GaTECP在光照条件下很明显的观察到了细胞的皱缩现象。由此可以说明GaTECP对A549细胞具有良好的光毒性，能够诱导癌细胞死亡。通过对细胞核进行Hoechst 33342的染色，从荧光显微镜下同样也可以看到前三个对照组的细胞核形态没有太大的变化，而药物在光照下的实验看到图中的细胞核数目明显变少，并且呈圆珠状聚集在一起（见图3）。

2.4 GaTECP对A549细胞内活性氧物种的影响

光动力治疗中其中很重要的一方面是光敏剂在受光照激发后产生单线态氧、羟基自由基和超氧阴离子自由基等活性氧物种。该物种可以通过染料H2DCF-DA染色显示绿色荧光［9］。从图4中可以看出在对照实验中并没有观察到活性氧物种的产生，而GaTECP在光照条件下可以通过荧光显微镜观察到明显的绿色荧光，说明光照射后细胞内有活性氧物种的产生。活性氧物种对细胞器的氧化损伤是导致细胞凋亡的一个重要因素。在明场显微照片中也可以明显看到GaTECP在光照下能促进A549细胞的凋亡。

2.5 GaTECP对A549细胞内线粒体膜电位的影响

线粒体是细胞外源性和内源性凋亡途径研究的一个重要细胞器［10，11］。从上面GaTECP的细胞定位实验可知GaTECP定位在线粒体上，而影响线粒体导致细胞凋亡的过程中其中很重要的一个特征是线粒体膜电位的降低。膜电位的变化一般通过JC-1染料的染色，观察其荧光的变化。图5是膜电位变化的荧光显示图。可以看出，三个对照组都显示红色荧光，说明线粒体膜电位正常，经过GaTECP孵育和光照处理的肿瘤细胞中，线粒体很明显看到有绿色荧光的产生。

图4 GaTECP在光照后产生活性氧物种。（A：暗对照；B：光照不加药对照；C：暗光加药对照；D：光照加药）

3 结束语

本文合成了GaTECP，并研究了其对三株肿瘤细胞的抗肿瘤活性。发现它对所试肿瘤细胞有较好的光毒性。GaTECP尤其对A549有很强的光毒性。它能被肿瘤细胞吸收，并主要分布在线粒体上。在光照条件下它能够产生活性氧物种，降低线粒体的膜电位，诱导癌细胞凋亡。

[1] Ethirajan M, Chen Y, Joshi P, et al. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy [J]. Chem Soc Rev, 2011, 40(1): 340-362.

[2] Horiuchi H, Hosaka M, Mashio H, et al. Silylation Improves the Photodynamic Activity of Tetraphenylporphyrin Derivatives In Vitro and In Vivo [J]. Chem Eur J, 2014, 20(20): 6054-6060.

[3] Lee C Y, Farha O K, Hong B J, et al. Light-Harvesting Metal-Organic Frameworks (MOFs): Efficient Strut-to-Strut Energy Transfer in Bodipy and Porphyrin-Based MOFs [J]. Journal of the American Chemical Society, 2011, 133(40): 15858-15861.

[4] DeRosa M C, Crutchley R J. Photosensitized singlet oxygen and its applications [J]. Coordination Chemistry Reviews, 2002, 233（2）：351-371.

[5] Agostinis P, Berg K, Cengel K A, et al. Photodynamic therapy of cancer: An update [J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(4): 250-281.

[6] Bugaj A M. Targeted photodynamic therapy - a promising strategy of tumor treatment [J]. Photoch Photobio Sci, 2011, 10(7): 1097-1109.

[7] Allison R R, Moghissi K. Photodynamic Therapy (PDT): PDT Mechanisms [J]. Clin Endosc, 2013, 46(1): 24-29.

[8] Wang H H, Jiang Y Y, Mahmood M H R, et al. β-Octafluorinated tetrakis(ethoxycarbonyl)porphyrin [J]. Chin Chem Lett, 2015, 26(5): 529-533.

[9] Hajare S N, Subramanian M, Gautam S, et al. Induction of apoptosis in human cancer cells by a Bacillus lipopeptide bacillomycin D [J]. Biochimie, 2013, 95(9): 1722-1731.

[10] Chen T, Liu Y, Zheng W-J, et al. Ruthenium Polypyridyl Complexes That Induce Mitochondria-Mediated Apoptosis in Cancer Cells [J]. Inorg Chem, 2010, 49(14): 6366-6368.

[11] Chen T, Wong Y S. Selenocystine induces apoptosis of A375 human melanoma cells by activating ROS-mediated mitochondrial pathway and p53 phosphorylation [J]. Cell Mol Life Sci, 2008, 65(17): 2763-2775.

Study on the Photodynamic Antitumor Activity of Gallium Porphyrin Complex

WANG Hua-hua，XIE An-na, ZHANG Zhao, LIU Hai-yang⋆
（Department of Chemistry, South China University of Technology, GuangZhou 510640 ）

5,10,15,20-tetra(ethoxycarbonyl)porphyrin Gallium(III) chloride （GaTECP） was prepared by reaction of 5,10,15,20- tetra(ethoxycarbonyl)porphyrin and GaCl3, and characterized by UV-Vis, high resolution mass and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Cytotoxicity of GaTECP towards human lung adenocarcinoma A549, cervical carcinoma Hela and Hep G2 cells were investigated using MTT method. GaTECP exhibited little cytotoxicity. However, the cytotoxicity to the tested tumor cell lines were greatly enhanced under light irradiation. The effect of GaTECP to the cell morphology and its localization in the tumor cells was further checked by using A549 cell lines. The determination of reactive oxygen species and the change of mitochondrial membrane potential was performed too. The results showed that the cell uptake GaTECP was located in the mitochondria of A549 cell. Under irradiation, ,reactive oxygen species and the decrease in the membrane potential of mitochondria could be observed, which eventually leds to cells apoptosis.

Porphyrin; Gallium; Antitumor activity; Cytotoxicity; Photodynamic Therapy

O614

A

2096-0387（2015）01-0001-04

国家自然科学基金（21171057， 21371059），华工中央高校基本科研业务费（x2hgD2141030）资助项目

简介：刘海洋，教授，博士生导师。

汪华华（1987-），男，浙江衢州人，在读博士，研究方向：无机化学。