探讨实时荧光定量PCR法检测血液新生隐球菌的临床意义

黄铭珊　金　霆

探讨实时荧光定量PCR法检测血液新生隐球菌的临床意义

黄铭珊金霆

作者单位：350101福州市，福建卫生职业技术学院（黄铭珊）350003福州市，福州市第一医院检验科（金霆）

目的探讨实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）法检测新生隐球菌感染的临床应用价值。方法选择2014年2月-2014年7月就诊的47例疑似新生隐球菌感染患者的血液标本，采用常规培养基培养方法以及RT-FQ-PCR法进行检测，计算检测新生隐球菌的阳性率，并进行统计学分析。采用RT-FQ-PCR法对新生隐球菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉、黑曲霉、大肠杆菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌和链球菌这些常见真菌和细菌的DNA进行检测，评价RT-FQ-PCR法的特异性。采用RT-FQ-PCR和常规培养基培养法对稀释至5个/mL的新生隐球菌菌液进行检测，评价RT-FQ-PCR法的灵敏度。结果采用RT-FQ-PCR法，以新生隐球菌特异性引物为探针对新生隐球菌和其他常见真菌及细菌进行检测，只有新生隐球菌出现荧光信号。RTFQ-PCR在5个/mL浓度的新生隐球菌菌液中检测出新生隐球菌，而常规培养基培养法未检测出。在47例疑似新生隐球菌感染患者中，常规培养基培养方法检测出11例，阳性率为23.40%，而RT-FQPCR法检测出14例，阳性率为29.79%，二者经比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论RT-FQ-PCR法与常规培养基培养法对新生隐球菌的检测具有很好的一致性。且RT-FQ-PCR法能够检测出较低浓度的新生隐球菌，较常规培养基培养法快速、灵敏度高、特异性强，可缩短报告时间，为临床早期诊断及治疗新生隐球菌感染提供可靠依据。

新生隐球菌；实时荧光定量PCR法；常规培养基培养法

doi：10.3969/j.issn.1674-7151.2015.01.008

广谱抗生素、免疫抑制剂的大量应用，获得性免疫缺陷综合症（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）等导致免疫受损疾病患者的增加，器官移植、化疗放疗等技术的普及，使得免疫受损人群逐渐增多，让越来越多人的生命受到深部真菌感染的威胁。新生隐球菌是深部真菌感染中隐球菌属的主要菌种之一，患者主要表现为中枢神经系统被侵犯。新生隐球菌系环境腐生菌，广泛生存于土壤和鸽粪中。正常人常处于新生隐球菌污染的环境中，但发病者极少，感染多发生于免疫功能低下者。新生隐球菌是免疫功能受损的AIDS患者最常见的感染真菌，也是导致患者死亡的重要原因［1］。新生隐球菌按血清学分为A、B、C、D和AD 5个型别，根据不同型别分为格特变种（血清型B、C）、grubii变种（血清型A）和新生变种（血清型D）3个变种，此外，还发现了新生变种和grubii变种的杂合体 （血清型AD）［2-4］。由于新生隐球菌感染的临床表现缺乏特异性，造成其早期诊断很困难，使其感染的诊断和治疗被延误。因此，建立一种简单、快速、有效判断新生隐球菌感染的新方法，对于临床新生隐球菌感染的诊断和治疗具有重要的意义［5，6］。本文采用实时荧光定量PCR （real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）方法和常规培养基培养方法，对47例疑似新生隐球菌感染患者的血液进行检测，对比其一致性和灵敏度，探讨RT-FQ-PCR法在检测血液新生隐球菌感染中的临床意义。

1　资料与方法

1．1临床资料收集2014年2月-2014年7月福州市第一医院47例疑似新生隐球菌感染患者的血液标本。其中男性31例，平均年龄（25.4±10.6）岁，女性16例，平均年龄（28.7±8.7）岁。根据《隐球菌感染诊治专家共识》［7］的诊断标准，其中14例患者为新生隐球菌感染。

1．2方法

1．2．1仪器与试剂RT-FQ-PCR采用7500RTFQ-PCR仪 （美国ABI），电热恒温培养箱 （DNP-9162，上海精宏），分光光度计（K5500，北京凯奥科技发展有限公司）。新生隐球菌培养采用沙氏琼脂培养基（HB0235-10，青岛海博生物技术有限公司）。

1．2．2RT-FQ-PCR模板的DNA提取取4 ml血液标本，以离心半径15 cm，5000 r/min离心1 min。去掉上清液，保留沉淀物，后续步骤参照Meyer等［8］的DNA提取方法进行DNA的提取。使用K5500超微量分光光度计对提取后的核酸进行检测，其OD260/OD280=1.897（高纯度DNA的 OD260/OD280为1.80～2.20）。

1．2．3RT-FQ-PCR的引物探针设计在这5种新生隐球菌中，其内转录间隔区 （internal transcribed spacer region，ITS）的序列具有种间特异性和种内保守性，可以作为鉴定新生隐球菌的目的序列。通过比对，在新生隐球菌的ITS序列中取一段高度保守的序列作为检测的目的序列，再利用Primer Express 3.0软件设计出特异性引物和探针。上游引物为NF：5＇-TTACCTGTTGGACTTGGATTTGG-3＇，下游引物为NR：5＇-CATAGGCCCAGCGAAACTTATT-3＇，探针为NP：5＇-ACCTGTCAGCCCGGC-3＇。其中荧光探针在5＇和3＇端分别标记“荧光发射基团”-FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518 nm处）和“荧光淬灭基团”-TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在582 nm处）。

1．2．4RT-FQ-PCR条件在50 μl体系中：10× PCR Buffer 5.0 μl、MgCl2（20 mmol/L）10.0 μl，上下游引物（10 pmol/L）各2.0 μl、Hot-Taq酶（5 U/L）0.5 μl、探针（10 pmol/μL）0.4 μl、dNTPs（20 μmol/L）0.6 μl、模板DNA 5 μl，加ddH2O至50 μl。在ABI 7500型荧光PCR仪上扩增，条件为：95℃15 min，94℃15 s，60℃60 s，40个循环。

1．2．5常规培养基培养方法将增菌后的血液标本接种于沙氏琼脂培养基，置于37℃培养2-5 d，出现乳白色黏液性菌落生长。该菌落呈现圆形的酵母样细胞，其外周有一层较厚的胶质样荚膜，荚膜宽3～5 μm，初为乳白色，后转变成橘黄色；尿素酶试验阳性（隐球菌产生的尿素酶分解尿素，使培养基变为红色）［9］。

1．2．6RT-FQ-PCR扩增反应检测新生隐球菌的特异性选择来自福州市第一医院的新生隐球菌（D2a-c）、光滑念珠菌（Y10）、克柔念珠菌（C6a）、烟曲霉 （A1）、黑曲霉 （A3）这些临床上常见的真菌DNA和大肠杆菌（DH5α）、肺炎球菌（Tn1545）、金黄色葡萄球菌（EMRSA15）、链球菌（Ingbritt FR）这些临床上常见的细菌DNA，用设计的新生隐球菌特异性引物探针对其进行荧光定量检测，观察结果。

1．2．7两种方法灵敏度比较取新生隐球菌菌数浓度为104个/mL的菌液，稀释至5个/mL，分别用RT-FQ-PCR法和常规培养基培养法来检测，计算两者的灵敏度。

1．2．8两种方法对47例疑似新生隐球菌感染患者的检测效率评价同时使用RT-FQ-PCR方法和常规培养基培养方法对47例疑似新生隐球菌感染患者的血液进行检测，用绝对阳性（确诊为新生隐球菌感染）作为衡量两种方法检测的效率，并进行统计学分析。

1．3统计学处理采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析，计数资料的比较采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1RT-FQ-PCR法检测新生隐球菌的特异性采用RT-FQ-PCR法检测新生隐球菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉、黑曲霉、大肠杆菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌和链球菌这些常见真菌和细菌的DNA，结果显示，以新生隐球菌特异性引物为探针，RT-FQ-PCR法只能特异性检测新生隐球菌，而对其他真菌和细菌没有荧光信号，见图1、图2。

图1　RT-FQ-PCR法检测新生隐球菌和其他真菌DNA基因扩增曲线图

图2　RT-FQ-PCR法检测新生隐球菌和细菌DNA基因扩增曲线图

2．2灵敏度比较将新生隐球菌菌数浓度稀释为5 个/mL时，采用常规培养基培养方法培养5 d后重复检测10次，均未检测到新生隐球菌；而采用RTFQ-PCR法重复检测10次，均检测到新生隐球菌。

2．3RT-FQ-PCR法和常规培养基培养法检测新型隐球菌的结果比较采用RT-FQ-PCR法对47例疑似新生隐球菌感染患者的血液标本进行检测，共检测出14例新生隐球菌感染，检测阳性率为29.79%；而采用常规培养基培养方法检测出11例新生隐球菌感染，检测阳性率为23.40%。两种检测方法经比较，差异无统计学意义（χ2=0.24，P＞0.05），见表1。

表1　RT-FQ-PCR法和常规培养基培养法检测新生隐球菌的结果比较［n（%）］

3　讨论

新生隐球菌是一种引起隐球菌病的深部感染真菌，主要侵犯中枢神经系统［10］。新生隐球菌广泛存在于自然环境中，可以从水果、蔬菜、土壤中分离出来，也可以从各种鸟类排泄物中分离出，而人类感染的最主要来源是从鸽粪中分离出的新生隐球菌［11］。随着AIDS、糖尿病患者的增加以及人们大量使用抗生素、移植手术后使用抗排斥药物、化疗药物等原因，使得免疫受损人群越来越多，导致新生隐球菌感染的患病率有明显的升高趋势。然而新生隐球菌感染的临床表现不具有特征性，易误诊为其他疾病而延误治疗。因此，急需找到一种灵敏度高、特异性强的方法来检测新生隐球菌，以便于临床早期诊断、早期治疗。

目前，检测新生隐球菌的方法有很多，常见的为传统的培养基培养法，其次为血清学方法和PCR指纹技术法。其中，常规培养基培养法是检测新生隐球菌的金标准，但该法灵敏度低，且检测时间长，不能作为早期检测新生隐球菌的理想方法。

本文采用RT-FQ-PCR法，以新生隐球菌特异性引物为探针，对新生隐球菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉、黑曲霉、大肠杆菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌和链球菌这些常见的真菌和细菌进行检测，结果显示，只有新生隐球菌出现荧光信号，而其他菌种均未出现荧光信号。说明RT-FQ-PCR法对新生隐球菌的检测具有很高的特异性。

本文研究将新生隐球菌菌数浓度为104个/mL的菌液稀释至5个/mL，分别采用RT-FQ-PCR法和常规培养基培养法进行检测，结果显示，只有RTFQ-PCR法检测出新生隐球菌，而常规培养基培养法未检测出。说明RT-FQ-PCR法可以检测低浓度的新生隐球菌菌液，具有较高的灵敏度，对于早期检测隐球菌感染具有一定的帮助。

本文研究分别采用RT-FQ-PCR法和常规培养基培养法对47例疑似新生隐球菌感染患者的血液标本进行检测，结果显示RT-FQ-PCR法检测的阳性率为29.79%（14/47），常规培养基培养法检测的阳性率为23.40%（11/47），经比较两种方法检测新生隐球菌的阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。说明两方法检测结果具有很好的一致性。

相对于其他检测新生隐球菌的方法，本文研究建立的RT-FQ-PCR法，具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，减少了很多繁杂的操作，缩短了检测时间，是一种便捷、灵敏、准确有效的临床检验新生隐球菌的新方法。有助于临床及早确诊新生隐球菌感染，为患者的治疗争取时间。

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4El Amraoui B，El Amraoui M，Cohen N，et al.Anti-Candida and anti-Cryptococcus antifungal produced by marine microorganisms.J Mycol Med，2014，24：e149-e153.

5Kelley EJ，Driebe EM，Etienne K，et al.Real-time PCR assays for genotyping of Cryptococcus gattii in North America.BMC Microbiol，2014，14：125.

6Chan M，Lye D，Win MK，et al.Chow A3，Barkham T4.Clinical and microbiological characteristics of cryptococcosis in Singapore：predominance of Cryptococcus neoformans compared with Cryptococcus gattii.Int J Infect Dis，2014，26：110-115.

7《中国真菌学杂志》编辑委员会.隐球菌感染诊治专家共识.中国真菌学杂志，2012，5：65-68，86.

8Meyer W，Marszewska K.Molecular typing of global isolates of Cryptococcus neoformans var.neoformans by polymerase chain reaction fingerprinting and randomly amplified polymorphic DNA-a pilot study to standardize techniques on which to base a detailed epidemiological survey.Electrophoresis，1999，20：1790-1799.

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10Park SH，Kim M，Joo SI，et al.Molecular Epidemiology of Clinical Cryptococcus neoformans Isolates in Seoul，Korea.ShMycobiology，2014，42：73-78.

11Danesi P，Firacative C，Cogliati M，et al.Multilocus sequence typing （MLST）and M13 PCR fingerprinting revealed heterogeneity amongst Cryptococcus species obtained from Italian veterinary isolates.FEMS Yeast Res，2014，14：897-909.

（本文编辑：李霦）

The clinical value of RT-FQ-PCR method for Cryptococcus neoformans detection in blood

HUANG Ming-shan1，JIN Ting2.
1The Health Professional Technical College of Fujian，Fuzhou 350101，China2Department of Clinical Laboratory，the First Hospital of Fuzhou，Fuzhou 350003，China

ObjectiveTo investigate the clinical application value of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（RT-FQ-PCR）method for Cryptococcus neoformans detection in blood.MethodsThe blood samples of 47 patients with probable Cryptococcus neoformans infection were selected from February 2014 to July 2014 in hospital.The blood samples were measured by routine culture method and detected DNA fragments by RT-FQ-PCR method.And the detection rates were evaluated by statistical method. Cryptococcus neoformans，Candida glabrata，Candida krusei，Aspergillus fumigatus，Aspergillus niger，Escherichia coli，Streptococcus pneumoniae，Staphylococcus aureus and Streptococcus were detected by RTFQ-PCR method to evaluate the specificity.The concentration of Cryptococcus neoformans solution was detected by RT-FQ-PCR method and routine culture method to evaluate the sensitivity.ResultsIn RT-FQ-PCR method detection，only Cryptococcus neoformans had fluorescence signal.In 5/mL concentration of Cryptococcus neoformans solution，Cryptococcus neoformans was only detected by RT-FQ-PCR method.In 47 cases probable Cryptococcus neoformans infection patients，positive rate of routine culture method was 23.40%（11 cases），and positive rate of RT-FQ-PCR method was 29.79%（14 cases）.The difference had no statistical significance（P＞0.05）.ConclusionRT-FQ-PCR method and routine culture method have a higher concordance for Cryptococcus neoformans detection.RT-FQ-PCR method can detect low concentration of Cryptococcus neoformans.Compared with routine culture method，RT-FQ-PCR has shorter time，higher sensitivity and specificity，which can reduce report time and provide reliable basis for clinical early diagnosis and treatment of Cryptococcus neoformans infection.

Cryptococcus neoformans；Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction method；Routine culture method

金霆，E-mail：fzf776@163.com

（2014-11-20）