心肌细胞的培养鉴定及β3-AR蛋白提取方法的比较

马苗苗，胡小芳，朱晓丽，王丽△，马依彤，杨毅宁，陈邦党

实验研究

心肌细胞的培养鉴定及β3-AR蛋白提取方法的比较

马苗苗1，胡小芳1，朱晓丽1，王丽1△，马依彤2，杨毅宁2，陈邦党2

目的 优化培养乳鼠心肌细胞的技术，筛选出简便、准确、特异的提取心肌细胞β3-肾上腺素能受体（β3-AR）膜蛋白的方法。方法 使用Ⅱ型胶原酶和差速贴壁法收集心肌细胞，分别用总蛋白法、超速离心法、试剂盒法提取心肌细胞β3-AR膜蛋白；BCA法进行蛋白定量；Western blot法检测蛋白样品中β3-AR和GAPDH相对含量及提取蛋白的特异性。结果 优化心肌细胞的培养方法可以使所得细胞产量大、浓度高，满足后续实验。试剂盒法提取蛋白的浓度（8.26±0.29）g/L＞总蛋白法提取法的（5.12±0.47）g/L＞超速离心法的（3.20±0.37）g/L，差异均有统计学意义。Western blot检测结果示，试剂盒提取法所得β3-AR膜蛋白含量（0.22±0.05）＞超速离心法（0.09±0.03）＞总蛋白提取法（0.01±0.01），差异均有统计学意义。结论 优化培养心肌细胞的方法可获得高产量、高纯度的细胞。试剂盒提取法可有效提高β3-AR膜蛋白的浓度和特异性。

受体，肾上腺素能β3；肌细胞，心脏；提取法；细胞培养技术；心肌细胞；β3-AR膜蛋白

心肌细胞的原代培养具有保持细胞特有结构和功能的特点，目前已被广泛应用于心血管等疾病的基础研究领域［1］。由于心肌细胞是终末细胞，不具备分化及增殖能力，如何成功培养高纯度、活力好的心肌细胞就成为许多研究的前提。近年来的研究表明β3-肾上腺素能受体（β3-adrenergic receptor，β3-AR）对心脏的作用不可忽视［2］。提取β3-AR蛋白是后续研究的关键环节，所得蛋白纯度的高低直接影响下一步蛋白免疫印迹实验的结果。Germack等［3-4］使用超速离心法获得心肌细胞β3-AR膜蛋白，其具体过程未见详细报道。本文选用3种方法提取心肌细胞β3-AR膜蛋白，应用Western blot方法检测该蛋白的表达情况，以确定出最佳的方法，为后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 出生1～3 d的SD乳鼠15只，雌雄不限，购自新疆医科大学第一附属医院实验动物中心。胎牛血清及牛血清白蛋白（BSA）、高糖培养基（DMEM）购自Gibco公司；双抗购自HyClone公司；谷氨酰胺、D-Hanks、TritonX-100、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）均购自Sigma公司；Ⅱ型胶原酶购自Worthington公司；正常驴血清、DAPI购自ImmunoReagents公司；小鼠抗心肌肌钙蛋白T抗体、β3-AR抗体购自Abcam公司；蛋白裂解液、BCA液购自Thermo公司；GAPDH抗体购于Cell Signaling Technology公司；二抗购于Invitrogen公司；膜蛋白提取试剂盒购于Merck公司。

1.2 心肌细胞的培养 取新生乳鼠的心脏，剪成0.5 mm3小组织块，加入1 g/LⅡ型胶原酶和10%BSA溶液，置于37℃摇床中消化分离心肌组织，待组织消化完全后，2次差速贴壁分离出心肌细胞，加入BrdU抑制非心肌细胞生长，台盼蓝染色计数心肌细胞后，接种于培养皿中。应用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2的培养箱中孵育。

1.3 心肌细胞的鉴定 取心肌细胞3×105/mL接种于盖玻片的6孔板内制作细胞爬片，48 h后取出爬片，40 g/L多聚甲醛固定15 min，2.5 mL/L Triton X-100透化10 min，驴血清室温封闭30 min，加入小鼠抗心肌肌钙蛋白T抗体，室温孵育1 h，加入荧光二抗，避光室温孵育1 h，再加入DAPI避光孵育1 min，倒置荧光显微镜下拍照。随机取10个高倍（×400）视野计数红色胞质细胞数及蓝色细胞核数。心肌细胞率（%）=红色胞质细胞数/蓝色细胞核数×100%。

1.4 3种提取β3-AR蛋白的方法

1.4.1 总蛋白提取法 取培养72 h形态良好的心肌细胞约2×106，置于冰上，弃去培养基，用预冷的PBS清洗3遍，加入500 mL的蛋白裂解液（RIPA∶PMSF按100∶1的比例混合），再分别加入5µL磷酸酶抑制剂和EDTA，冰上裂解5 min后，用细胞刮齿将细胞裂解产物刮下，收集至离心管内，超声波处理3 min，然后14 000 r/min，4℃离心15 min，取上清，于-80℃保存。

1.4.2 超速离心提取法 细胞裂解方法与总蛋白法一致，在4℃离心15 min后，收集上清置于超速离心机中，100 000 r/ min，4℃离心30 min，沉淀用PBS重悬。加入1%Triton X-100，4℃放置2 h，再次100 000 r/min，4℃离心30 min，收集上清，-80℃保存。

1.4.3 试剂盒提取法 按照 ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit试剂盒说明书进行操作，使用较温和的Buffer 2A提取。冰上操作，用预冷的PBS清洗3遍，培养皿中加入3 mL PBS，再用刮齿刮下细胞，收集到15 mL离心管中，1 000 r/min，4℃离心5 min。弃去上清液并加入Buffer 1和蛋白酶抑制剂，重悬，冰上孵育10 min。1 000 r/min，4℃离心5 min，取下层沉淀加入Buffer 2A和蛋白酶抑制剂，再次重悬，室温孵育45 min。再次16 000 r/min，4℃离心15 min，收集上清，-80℃保存。

1.5 BCA法对蛋白进行定量分析 BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，先将A、B液按50∶1的比例配制成嫩绿色的工作液，用PBS按一定浓度稀释配制标准品，待测样品蛋白稀释10倍。96孔板中加入反应体系，放置37℃恒温箱30 min，562 nm波长处测得光密度（OD）值，计算蛋白浓度。

1.6 Western blot检测 按每孔30 μg上样，SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜，脱脂牛奶室温封膜，0.5%TBST洗膜，加入一抗，4℃过夜。洗完膜后二抗再孵育1 h，用ECL法进行显色，Bio-Rad成像分析系统扫描，Image Lab软件分析灰度值。以GAPDH作内参，目的蛋白与内参显色条带的灰度比值代表目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 心肌细胞的荧光鉴定 心肌细胞培养48 h后，镜下可见细胞呈梭形及多边形，折光性强，有自发性的搏动，但节律和强度不同，见图1。倒置荧光显微镜下观察，部分细胞可见双核，细胞胞浆被抗心肌肌钙蛋白T（cTnT）抗体特异性染成红色，DAPI将细胞核染为蓝色，计数后所得心肌细胞纯度达95%，见图2。

2.2 BCA法测定提取蛋白浓度结果 试剂盒提取法所得蛋白的浓度（8.26±0.29）g/L＞总蛋白提取法（5.12±0.47）g/L＞超速离心提取法（3.20±0.37）g/L，差异均有统计学意义，见图3。

2.3 Western blotting检测结果 总蛋白提取法只有GAPDH 1条带，超速离心提取法有多条带，试剂盒提取法有目的β3-AR膜蛋白和GAPDH 2条带。试剂盒提取法所得β3-AR膜蛋白含量（0.22±0.05）＞超速离心提取法（0.09±0.03）＞总蛋白提取法（0.01± 0.01），差异均有统计学意义，见图4。

Fig.2 Fluorescent identification of cardiomyocytes（×400）图2 心肌细胞荧光鉴定（×400）

Fig.3 Protein concentration in the each groups图3 各组蛋白浓度比较

Fig.4 Level of β3-AR detected by Western blot图4 Western blot检测β3-AR膜蛋白表达

3 讨论

自心肌细胞成功培养以来，人们就不断完善和改进分离、纯化的方法，以便获得更高活力和产量的心肌细胞［5］。本文借鉴前人的经验，对Kim do等［6］的方法进行改良，培养出纯度较高、活力较强的原代乳鼠心肌细胞，以满足科研的要求。

实验中采用含BSA的Ⅱ型胶原酶，这点不同于其他的研究［7-8］，目的为保证细胞在消化过程所需营养，降低细胞的死亡率。消化过程均在37℃条件下完成，只要与细胞接触的液体均保持在37℃，以减少外界环境对细胞的刺激。通过两次差速贴壁每次50 min，得到纯度较高的心肌细胞，加入BrdU抑制了非心肌细胞生长，并用台盼蓝计数心肌细胞，去除死细胞的影响。实验中发现，心肌细胞接种密度不宜过低，否则会影响细胞间交流，不利于细胞生长。荧光鉴定显示培养48 h后细胞状态最好，所得细胞产量大、成活率较高，纯度可达95%，其纯度和存活率均能满足后续提取膜蛋白的实验研究要求。

β3-AR为膜受体蛋白，由7个22～28个氨基酸残基构成的疏水跨膜域组成，含3个胞内环和3个胞外环以及胞内的C端和胞外的N端［9］。现行的膜蛋白提取方法有很多种，如超声破碎法、反复冻融法、低渗裂解法、超速离心法等［10］。不同的实验室根据所提组织或细胞及膜蛋白种类不同，采取不同的破膜方法。本实验的研究对象为原代培养的乳鼠心肌细胞，细胞无法进行增殖和传代，实验所需细胞量较大，在获取细胞上较为困难。β3-AR膜蛋白在正常的心肌细胞上表达量少［11-12］，只有在受到外界刺激，如去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、血管紧张素Ⅱ等诱导作用时其表达量才有所增高［13］。正是由于β 3-AR复杂的结构，在提取时受到诸多条件的限制，所以在获得蛋白上需要更高的要求。

总蛋白提取法可提取膜蛋白、胞浆蛋白和核蛋白，该方法对疏水性跨膜蛋白提取效率有限，最终获得的膜蛋白率低。周斌等［14］对猪肾细胞进行膜蛋白提取，发现超声提取的总蛋白浓度最高，但此方法破坏了膜的完整性。本实验中Western blot结果几乎检测不到β3-AR膜蛋白的表达，很可能是因为β3-AR膜蛋白被破坏，或者是其在总蛋白中浓度较小，不易检测到。

有研究表明，细胞膜蛋白结构复杂，在细胞中存在微观不均一性，提取过程中易被破坏，其分离纯化一直是个难点［15］。本实验发现超速离心收集到的膜蛋白浓度最低，Western blot结果出现多条杂带，这很可能是长时间的高速离心使蛋白丢失和膜结构降解，从而使获取的蛋白特异性降低。再次，由于超速离心法操作较为复杂，目前不推荐应用于少量细胞膜蛋白的提取。

本实验中所用的试剂盒为特殊的7次跨膜蛋白提取试剂盒，按照试剂盒要求使用较温和的试剂裂解细胞，最终获得蛋白浓度较高。Western blot结果显示β3-AR膜蛋白特异性较好，无杂带、拖带现象，并且操作简便、快速，不要求过高的设备和条件，对于没有超速离心机的实验室，试剂盒提取法操作简单，膜蛋白收获率较高，是较为理想的膜蛋白提取方法。

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（2014-11-12收稿 2015-01-20修回）

（本文编辑 闫娟）

Cultured cardiomyocytes identificaiton and different methods of extracting β3-AR membrane protein comparison

MA Miaomiao1，HU Xiaofang1，ZHU Xiaoli1，WANG Li1△，MA Yitong2，YANG Yining2，CHEN Bangdang2
1 Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital，School of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832008，China；
2 Heart Centre，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
△Corresponding AuthorE-mail：mcmwl@163.com

Objective To optimize primary cultures techniques of isolating neonatal rat cardiomyocytes and to compare three different methods of extracting β3-adrenergic receptor（β3-AR）membrane protein from cultured neonatal rat cardiomyocytes.Methods TypeⅡcollagen and differential velocity adhesion were used to collect primary cardiomyocytes.Total protein method，ultracentrifugation method，extract kit method were used to isolate cardiomyocytes β3-AR membrane proteins.The BCA method was applied for protein quantification.Relative content of β3-AR membrane protein and GADPH in the sample were examined by western blot.Results Optimizing culture and isolation skills can produce a great quantity of cardiomyocytes in high concentration.The kit method acquired a higher level of protein concentration（8.26±0.29）g/L than total protein method（5.12±0.47）g/L does than ultracentrifugation method（3.20±0.37）g/L does all of which were with significant difference（P＜0.05）.The concentration of β3-AR membrane protein was higher if obtained by kit method（0.22± 0.05）than ultracentrifugation method（0.09±0.03）than total protein method（0.01±0.01）with significant difference（P＜0.05）.Conclusion optimizing methodology can obtain abundant myocardial cells in high concentraion.The kit method of isolating primary cultured β3-AR membrane proteins result in improved concentration and specificity of membrane protein.

eceptors，adrenergic，beta-3；myocytes，cardiac；extraction；cell culture techniques；cardiomyocytes；β3-AR membrane protein

R331

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.006

国家自然科学基金-地区科学基金项目（81260028）；石河子大学科学技术研究发展计划“自然科学与技术创新”团队创新项目（2011ZRKXTD-07）

1新疆石河子大学医学院第一附属医院心内科（邮编832008）；2新疆医科大学第一附属医院心脏中心

马苗苗（1989），女，硕士在读，主要从事冠心病的临床与基础研究

△E-mail：mcmwl@163.com