PPARγ对大鼠心肌缺血/再灌注后恶性心律失常的影响

何学恕，莫新玲，陈华，谢婷

PPARγ对大鼠心肌缺血/再灌注后恶性心律失常的影响

何学恕，莫新玲△，陈华，谢婷

目的 探讨大鼠心肌过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ对缺血/再灌注（I/R）后恶性心律失常的影响。方法 24只SD大鼠随机分为4组：假手术组（Sham组），缺血/再灌注组（I/R组），罗格列酮+缺血/再灌注组（ROS组），PPARγ抑制剂GW9662+缺血/再灌注组（GW组），每组6只。采用冠状动脉左前降支结扎法制造I/R动物模型，缺血30 min，再灌注2 h。全程肢体Ⅱ导联心电图观察各组恶性心律失常发生次数并记录校正QT间期（QTc）的变化，RT-PCR检测PPARγ mRNA表达。结果 ROS组发生5例恶性心律失常，I/R组2例，GW组1例，Sham组0例。ROS组的QTc间期在再灌注期较其他3组延长（均P＜0.05），与I/R组和ROS组相比，GW组的QTc间期在缺血30 min及再灌注过程中缩短（均P＜0.05）。与Sham组相比，其他3组PPAR-γ mRNA表达明显升高（均P＜0.05），ROS组PPARγ mRNA表达水平最高，GW组较I/R组和ROS组表达下调（均P＜0.05）。结论 PPARγ过表达可能导致心肌I/R恶性心律失常的发生。

PPARγ；心肌；再灌注损伤；心律失常；罗格列酮

心肌缺血/再灌注（I/R）损伤是指心肌在缺血基础上恢复血供后，结构功能损伤及代谢障碍加重的现象，再灌注心律失常是其常见并发症之一［1］。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ是一种依赖配体激活的转录因子，其在心肌的表达量是血管壁的5倍［2］。噻唑烷二酮类药物是PPARγ合成配体，研究显示其对缺血心肌有保护作用［3-4］。目前关于心肌PPARγ过表达对缺血/再灌注恶性心律失常的影响如何报道较少。本研究拟通过观察大鼠心肌组织PPARγ表达的变化对缺血/再灌注心律失常的影响，以期为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 罗格列酮及PPARγ抑制剂GW9662、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司，超纯RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR反应试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，DNA Marker购自杭州碧云天，引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。BL-420F生物功能实验系统购自成都泰盟科技公司，电脑动物呼吸机购自江西特力公司。

1.2 实验动物及分组 SPF级雄性SD大鼠24只，体质量235～255 g，购自广西医科大学动物实验中心。按随机数字表法分为4组：Sham组（开胸后冠脉左前降支只穿线，不结扎）；I/R组（结扎冠脉左前降支缺血30 min，再灌注120 min）；罗格列酮+缺血/再灌注（ROS）组（术前腹腔注射罗格列酮6 mg/kg，以后操作同I/R组）；GW9662+缺血/再灌注（GW）组（术前GW9662腹腔注射4 mg/kg，以后操作同I/R组）。每组6只。

1.3 建模 术前大鼠经10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，BL-420F生物功能实验系统心电监测。气管切开插管，人工呼吸机辅助通气，频率62次/min，吸呼比1.5∶1。胸部去毛消毒后开胸，以6号带线细针在冠状动脉根部下1～2 mm、肺动脉和左心耳之间穿过，中间垫一硬质海绵条，止血钳夹紧胸壁创口，观察心电图变化；心电图ST段抬高判断为结扎成功。30 min后松止血钳，拔出硬质海绵条，再灌注2 h。结束后迅速剪下心脏，在心室前壁相同位置留取心肌组织液氮冷冻。

1.4 心电图观察 记录各组缺血/再灌后出现恶性心律失常（室性心动过速、室颤）的例数，比较各组发生率。采用Bazett公式计算心率校正QT间期（QTc），QTc=QT/（RR）1/2，以P-R间期水平为基线，从QRS起点与T波终点之间距离为QT间期，每个时间点测6个波形，取平均值，分别观察术前开始时，缺血15 min、30 min，再灌注拆线1 h、2 h时QTc间期变化。

1.5 RT-PCR检测PPARγ mRNA表达 取各组大鼠心肌组织，提取总RNA并测定浓度。取5 μg RNA逆转录为cDNA后行PCR反应。引物序列如下：PPARγ上游 5′-TGGACCTCTCTGTGATGG-3′，下游5′-CGCACTTTGGTATTCT TG-3′，产物长度173 bp；内参GAPDH上游5′-TACCCACGGCAAGTTCAACG-3′，下游5′-CACCAGCATCACCCCATTT G-3′，产物长度122 bp。反应条件：94℃5 min；94℃30 s，54℃45 s，30个循环；72℃5 min。4组样品同时扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析各扩增带吸光度值，以目的基因与GAPDH吸光度比值计算相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件分析，计量资料以±s表示，总体变化趋势比较采用析因方差分析，组内不同时间点比较、同一时间点不同组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心电图的变化 Sham组无恶性心律失常发生，I/R组出现2例，GW组1例，ROS组5例。同组大鼠QTc间期在5个时间点的变化趋势不全相同（F=45.226，P＜0.01），同一时间点4组大鼠间不全相同（F=45.594，P＜0.01），时间与处理因素有交互作用（F=24.916，P＜0.01），即4组大鼠心电图QTc间期在5个时间点的变化趋势不全相同。I/R组与ROS组大鼠QTc间期在缺血30 min、再灌注1 h、再灌注2 h时均高于Sham组，GW组大鼠QTc间期在再灌注期均低于ROS组和I/R组（均P＜0.05）；4组间大鼠QTc间期在术前差异无统计学意义，见表1。

Tab.1 Comparison of QTc interval of ECG between four groups表1 各组大鼠心电图QTc间期的比较（ms，±s）

Tab.1 Comparison of QTc interval of ECG between four groups表1 各组大鼠心电图QTc间期的比较（ms，±s）

＊＊P＜0.01；组间比较：A与Sham组比较，B与I/R组比较，C与ROS组比较，P＜0.05；组内比较：a与术前比较，b与缺血15 min比较，c与缺血30 min比较，P＜0.05；ROS组再灌注1 h时n=5，2 h时n=4，其余时间点n=6，其余3组各时间点n=6。

组别Sham组I/R组ROS组GW组F术前83.83±3.25 82.33±2.88 83.00±3.69 82.67±3.93 0.208缺血15 min 87.50±3.08 97.67±3.33a69.83±4.22Ba90.00±2.28BCa76.350＊＊缺血30 min 86.33±6.31 103.17±10.17Aa111.17±5.31Aa93.83±2.79BCa15.716＊＊组别Sham组I/R组ROS组GW组F再灌注1 h 84.33±2.66 94.67±5.24Aac102.60±4.62ABabc77.50±5.24BCb32.687＊＊再灌注2 h 84.83±2.40 101.00±3.85Aa106.75±4.57ABab84.17±3.43BCb53.700＊＊F 0.947 12.158＊＊86.534＊＊9.333＊＊

2.2 各组PPARγ mRNA表达比较 各组PPARγ mRNA相对表达量分别为Sham组0.155±0.047，I/R 组0.485±0.048，ROS组0.672±0.064，GW组0.293± 0.046，4组间表达差异具有统计学意义（F=104.181，P＜0.05）。与Sham组比较，其他3组PPARγ mRNA表达上调（均P＜0.05）。ROS组PPARγ mRNA表达量明显高于其他3组，GW组较I/R组和ROS组PPARγ mRNA表达下调（P＜0.05），见图1。

Fig.1 Expressions of PPARγ mRNA in four groups图1 各组PPARγ mRNA表达水平

3 讨论

PPARs属于核受体超家族的转录因子，有α、β、γ 3种亚型。人PPARγ基因定位于3p25，其在一系列病理和生理过程中发挥重要作用［5］。PPARγ激动剂罗格列酮、吡格列酮等能促进其表达。陈文雁等［6］发现PPARγ1过表达对大鼠心肌有保护作用。而Loebstein等［7］发现长期采用罗格列酮治疗的2型糖尿病患者心血管风险事件增加。Palee等［8］研究发现罗格列酮能增加缺血/再灌注后的室颤倾向。本研究发现ROS组大鼠较其他组大鼠更易出现心律失常，具体表现为室速持续次数、时间增加，短期改变明显，室颤增加及室颤发作时间缩短，且2只大鼠死于再灌注过程；ROS组大鼠再灌注1 h、2 h时心电图QTc间期延长较其他组显著，与国外文献报道相似［8-9］。

正常情况下心肌低表达PPARγ。Lee等［10］研究表明PPARγ在糖尿病相关的心脏疾病中表达升高。Morrow等［9］研究发现吡格列酮预处理转基因模型小鼠PPARγ过表达可增加室性心律失常发生率。本研究发现，缺血/再灌注模型大鼠PPARγ表达上调，罗格列酮预处理后进一步促进PPARγ表达。ROS组大鼠再灌2 h后QTc间期较其他组显著延长，可能与心室复极受损有关。而使用PPARγ抑制剂GW9662干预后，恶性心律失常发生率明显减低，较I/R组及ROS组PPARγ表达下调，推测PPARγ可能介导了再灌注心律失常。过高的PPARγ表达可能会使心肌细胞脂质异常蓄积和心肌电生理发生重构，而心肌细胞动作电位的复极相依赖于钠离子和钙离子去极化与钾离子复极化的平衡，正常心律的发生基于钠、钾、钙离子通道的正常开放关闭；心肌细胞脂质蓄积和心肌电重构影响正常离子通道的开放和关闭，尤其是钾离子通道开放减缓甚至减少，引起动作电位时相延长，从而导致心室除极和复极异常，心电图表现为室性心律失常。本研究也存在不足之处，未进行大鼠心肌电生理研究，无法检测离子通道的变化过程。

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（2014-10-28收稿 2014-12-02修回）

（本文编辑 胡小宁）

Effects of PPARγ on malignant arrhythmia in myocardial ischemia/reperfusion model rats

HE Xueshu，MO Xinling△，CHEN Hua，XIE Ting
Department of Cardiology，The Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001，China
△Corresponding Author E-mail:glmxl1003@163.com

Objective To investigate the effects of peroxisome proliferator activated receptor gamma（PPARγ）on malignant arrhythmia in myocardial of ischemia/reperfusion（I/R）rats.Methods Twenty-four SD rats were randomly divided into four groups:Sham group，I/R group，rosiglitazone（ROS）group and PPARγ inhibitor GW9662（GW）group.The myocardial I/R injury was induced by ligation of the left anterior descending coronary artery，with ischemia for 30 min and reperfusion for 2 h.The whole process limbⅡlead electrocardiogram was applied to observe the frequency of malignant arrhythmia and record the corrected changes of QT（QTc）interval.RT-PCR was used to detect the expression of PPARγ mRNA.Results There were 5 cases of malignant arrhythmia in ROS group，2 in I/R and 1 in GW group，0 was found in Sham group.There was a prolongation of the QTc interval in ROS group than the other groups after ischemic stage（P＜0.05）.Compared with I/R group and ROS group，the QTc intervals were shorten in ischemia 30 min and reperfusion process in GW group（P＜0.05）.Compared with sham group，the expression of PPARγ mRNA was significantly increased in other three groups（P＜0.05）.The expression level of PPARγ mRNA was the highest in ROS group.The expression level of PPARγ mRNA was reduced in GW group compared with that of I/R group and ROS group（P＜0.05）.Conclusion Over expression of PPARγ may lead to the occurrence of malignant arrhythmia in myocardial ischemia/reperfusion rats.

PPAR gamma；myocardium；reperfusion injury；arrhythmia；rosiglitazone

R541.7

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.011

广西壮族自治区卫生厅自筹课题（Z2013492）；广西壮族自治区卫生厅重点科研课题（重2010049）

桂林医学院附属医院心内科（邮编541001）

何学恕（1985），男，硕士在读，主要从事高血压、冠心病的防治研究

△E-mail:glmxl1003@163.com