STAT3和VEGF在皮肤恶性黑色素瘤组织中的表达及临床意义

李银玲, 肖明明, 表贞淑, 侯 慧, 杨 锎, 祝立丽, 景士兵

实验研究

STAT3和VEGF在皮肤恶性黑色素瘤组织中的表达及临床意义

李银玲, 肖明明, 表贞淑, 侯 慧, 杨 锎, 祝立丽, 景士兵

目的 探讨信号传导与转录激活因子3和血管内皮生长因子在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及临床意义。方法 采用组织芯片免疫组化学S- P法、免疫印迹法检测信号传导与转录激活因子3及血管内皮生长因子在35例皮肤恶性黑色素瘤、30例色素痣组织中的表达情况。结果 在皮肤恶性黑色素瘤组织中,信号传导与转录激活因子3、血管内皮生长因子的表达阳性率分别为65.7%、60.0%，均明显高于在色素痣中表达的阳性率(P<0.01)。皮肤恶性黑色素瘤中信号传导与转录激活因子3和血管内皮生长因子表达均与肿瘤的细胞生长、浸润深度和淋巴结转移呈正相关(P<0.05)；信号传导与转录激活因子3和血管内皮生长因子的表达呈显著正相关(P<0.001)。结论 信号传导与转录激活因子3可能通过上调血管内皮生长因子的表达，促进皮肤恶性黑色素瘤组织中新生血管的形成，与肿瘤生长、侵袭和转移呈密切相关。为皮肤恶性黑色素瘤的靶向性治疗提供新思路。

皮肤恶性黑色素瘤; 信号传导与转录激活因子3; 血管内皮生长因子; 免疫组化学

皮肤恶性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma, CMM)是一种起源于外胚叶神经嵴黑素细胞的高度恶性的肿瘤。易早期发生侵袭和转移，预后差，死亡率高，严重影响人类的健康和生存质量。本实验主要通过免疫组化法检测CMM组织中信号传导与转录激活因子3(signal transducers and transcription activators 3， STAT3)和血管内皮生长因子(vascular endothelail growth factor， VEGF)蛋白的表达情况，探讨其与临床病理特征的关系及二者之间表达的关系。

1 临床资料

选用我院病理科2005年1月至2014年6月活检标本存档蜡块。CMM 35例，男性19例，女性16例，平均年龄(52.50±8.57)岁；色素痣30例，男性15例，女性15例，平均年龄(48.35±9.86)岁。CMM根据Clerk分级:Ⅰ级2例、Ⅱ级5例、Ⅲ级13例、Ⅳ级9例、Ⅴ级6例；根据有无转移分3期:Ⅰ期(无转移)21例、Ⅱ期(伴局部淋巴结转移)9例、Ⅲ期(伴远处器官转移)5例。色素痣为对照组, 其中皮内痣15例、复合痣8例、交界痣7例。所有标本均为手术切除获得,术前未经放疗、化疗和其他免疫治疗,患者均知情同意。

2 实验方法

2.1 试剂 STAT3多抗,VEGF多抗,SABC试剂盒及显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。2.2 构建组织芯片 组织芯片整齐排列，制成蜡块，连续切片常规作HE染色，切片厚度为5 μm，裱片温度控制在40 ℃左右，余同常规制片，用于免疫组织化学染色的组织片裱于经10%APES的丙酮液处理的载玻片上，用紫外线灯烤片以防止掉片或移位。2.3 免疫组织化学染色 组织芯片常规脱蜡，切片浸于50 mmol/L EDTA溶液中(pH 8.0)，微波抗原修复10 min，冷却至室温，充分水洗，PBS浸洗，滴加正常山羊血清封闭液，室温封闭20 min，甩去多余液体，不洗，加入VEGF单抗或STAT3单抗4 ℃过夜；PBS洗涤；滴加SP 9000通用型生物素标记二抗，37 ℃孵育20 min，PBS液冲洗2 min，3次；显色剂显色；自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片。由正常小鼠血清代替一抗作替代对照，PBS作空白对照。2.4 蛋白质提取与Western blot鉴定 收集新鲜组织在离心管中，使用NP40裂解液冰上匀浆组织。13 000 g 4 ℃离心30 min，将上清转到新的离心管中，取上清5 μl，选用G250考马斯亮蓝方法进行蛋白定量。将蛋白定量后，取40 μg总蛋白经10% SDS- PAGE凝胶分离，4 ℃过夜40 V恒压转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h。根据目标蛋白的分子量，切割PVDF膜，用一抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1∶5000稀释)二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL显影，Image Lab图像分析软件测定灰度值，以GAPDH为内参照记录各目的蛋白的相对灰度值。2.5 结果判断 STAT3以肿瘤细胞的胞浆和(或)细胞核中出现棕黄色颗粒为染色阳性，VEGF以肿瘤细胞的胞质中出现棕黄色颗粒为染色阳性。高倍镜下随机选取5个视野进行计数，着色细胞<5%为阴性(-)，5%～25%为弱阳性(+)，26%～50%为阳性()，>50%为强阳性()。2.6 统计学处理 采用SPSS 10.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。两因素间的相关性采用Spearman等级相关检验分析。

3 结果

STAT3和VEGF在CMM中的阳性率为65.7%和60.0%,在色素痣中的阳性率为16.7%和3.3%,二者差异具有统计学意义(P<0.01)。STAT3在CMM组织中主要在肿瘤细胞胞浆内表达(图1) ，在色素痣组织中大部分无表达(图2) ；VEGF在CMM组织中主要在肿瘤细胞胞质内表达(图3)，在色素痣组织中基本无表达(图4)。免疫印迹法(westernblot，WB)检测正常皮肤、色素痣、CMM各5例，STAT3和VEGF蛋白在CMM中的表达明显强于皮内痣及正常皮肤(图5)。CMM组织中STAT3及VEGF表达与Clark分级和有无淋巴结转移密切相关(P<0.05，表1)，二者的表达差异具有统计学意义(P<0.001，表2)。

4 讨论

信号转导和转录活化因子(STATs) 家族包括7个成员：STAT1～4、STAT5a、STAT5b 和STAT6b，STAT3最易发生结构磷酸化和诱导肿瘤发生[1]。在生理状态下，正常细胞中STAT3 的激活短暂，但在恶性肿瘤细胞中STAT3 被持续激活，并促进肿瘤的增殖、侵袭和转移[2]。研究证实，在多种人类肿瘤细胞中，STAT3蛋白高表达可上调与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和转移相关的靶基因表达，如细胞周期基因的原癌基因(c- myc、pim- 1)、细胞周期蛋白(cyclin)、细胞凋亡抑制因子Bcl家族、热休克蛋白、VEGF等，所以STAT3蛋白可能是参与诱发肿瘤的关键蛋白。

VEGF 是目前已知最重要的促血管生成因子之一， 其广泛表达于成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及肿瘤细胞等多种细胞，但其受体(flt- 1、flk- 1)则仅表达于血管内皮细胞,因此是一个特异作用于血管内皮细胞的因子，并具有多种生物学功能： ⑴选择性增强血管内皮细胞有丝分裂,刺激内皮细胞增殖和血管形成[3]；⑵增强微小血管的渗透性,使血浆大分子外渗沉积在血管外的基质中,为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养；⑶抑制抗原呈递细胞的成熟，逃避免疫应答[4]。VEGF与肿瘤的发生和转移密切相关，能直接反映肿瘤细胞的生长速度和转移倾向，可作为肿瘤代谢及转移的标志。二者在CMM中表达较色素痣组强, 可推测在CMM中STAT3和VEGF有促进微血管生成的作用。因肿瘤的预后与组织类型、分级、淋巴结转移等多种情况有关。研究中STAT3和VEGF在Clark分级高的和有淋巴结转移组的阳性表达率显著高于Clark分级低的和无淋巴结转移组，说明它们与CMM细胞生长、局部侵袭和淋巴结转移密切相关。有学者认为，STAT3和VEGF在体内外协同刺激内皮细胞的增生和毛细血管的生成。Wang等[5]研究证明，利用RNA干预技术沉默STAT3可以降低VEGF的表达。Cheong等[6]报道，异泽兰黄素可以通过阻断胃癌MKN- 45细胞的STAT3通路而抑制VEGF表达。本研究也表明,在CMM组织中STAT3和VEGF共阳性表达与共阴性表达差异具有统计学意义(P<0.05)。说明STAT3与VEGF呈正相关，推测STAT3和VEGF在促进血管形成方面有协同作用。可能与STAT3调控VEGF及其受体的表达，诱导VEGF的合成有关。同时提示了CMM在控制新血管生成治疗方法中应多因素联合应用。

图1 STAT3在CMM中阳性表达(SP ×400) 图2 STAT3在色素痣中阴性表达(SP ×100) 图3 VEGF在CMM中阳性表达(SP ×400) 图4 VEGF在色素痣中阴性表达(SP ×100) 图5 WB法检测STAT3、VEGF在正常皮肤组织(1)、色素痣(2)及CMM(3)中蛋白表达情况

Fig 1 The positive expression of STAT3 protein in CMM (SP ×400). Fig 2 The negative expression of STAT3 protein in nevus (SP ×100). Fig 3 The positive expression of VEGF protein in CMM (SP ×400). Fig 4 The negative expression of VEGF protein in nevus (SP ×100). Fig 5 The expression of STAT3, VEGF protein in normal skin tissue(1), nevus(2) and CMM(3) by WB.

表1 STAT3、VEGF蛋白表达与CMM临床病理特征的关系

Tab 1 Relationship between the expression of STAT3 and VEGF and clinical pathological characteristics of CMM

因素Clark分级(例,%)Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级Ⅳ级Ⅴ级淋巴结转移(例,%)Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期STAT302(40.0)8(61.5)7(77.8)6(100.0)10(47.6)8(88.9)5(100.0)VEGF1(50.0)2(40.0)6(46.2)6(66.7)6(100.0)9(42.9)7(77.8)5(100.0)

表2 STAT3和VEGF在CMM中的表达相关性

STAT3、VEGF可能在CMM发生、发展、浸润及转移等方面都发挥着重要作用。其对判断CMM的淋巴结转移，抗血管治疗和预后具有临床应用价值，可以作为CMM临床辅助诊断，也可用于评价抗血管生成药物的治疗效果。

[1] 王梅平, 陈燕凌, 黄 焱, 等. 白细胞介素6促胆囊癌细胞增殖、侵袭与JAK/STAT3信号通路的关系[J]. 中国普通外科杂志, 2013,22(8):982- 987.

[2] 叶立群, 张谢夫, 赵春临, 等. 结直肠癌组织STAT3和MMP- 9表达及其与血管生成相关性的研究[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2011,18(12):949- 952.

[3] 哈建利, 张泽波. 卵巢癌组织中VEGF的表达及其与MVD的关系[J]. 咸宁学院学报:医学版, 2011,25(4):296- 298.

[4] 杨宪广, 孙 冀.VEGF研究进展及其在喉癌中的相关研究实用肿瘤学杂志[J]. 实用肿瘤学杂志, 2011,25(6):575- 578.

[5]WangXH,LiuBR,QuB,etal.SilencingSTAT3mayinhibitcellgrowththroughregulatingsignalingpathway,telomerase,cellcycle,apoptosisandangiogenesisinhepatocellularcareinoma：potentialusesforgenetherapy[J].Neoplasma, 2011,58(2):158- 171.

[6]CheongJH,HongSY,ZhengY,etal.EupatilininhibitsgastriccancercellgrowthbyblockingSTAT3-mediatedVEGFexpression[J].JGastricCancer, 2011,11(1):16- 22．

Expression of signal transducers and transcription activators 3 and vascular endothelial growth factor in cutaneous malignant melanoma and its clinical significance

LIYin-ling,XIAOMing-ming,BIAOZhen-shu,etal.

(DepartmentofDermatology,People′sHospitalofLiaoningProvince,Shenyang110016,China)

Objective To explore the expression of signal transducers- transcription activators 3 and vascular endothelial growth factor in cutaneous malignant melanoma and its clinical significance. Methods The expression of signal transducers- transcription activators 3 and vascular endothelial growth factor were examined in 35 cases of cutaneous malignant melanoma and 30 cases of nevus by immunohistochemistry and Western blot. Results The positive rates of signal transducers- transcription activators 3 and were 65.7% and 60.0% in the cutaneous malignant melanoma, which were significantly higher than those which were 15.4% and 3.3% in the nevus (P<0.01).Boththeexpressionofsignaltransducers-transcriptionactivators3andvascularendothelialgrowthfactorweresignificantlycorrelatedtogrowthoftumorcell,depthoftumorinvasionandtumorlymphnodemetastasis(P<0.05).Moreover,asignificantcorrelationwasfoundbetweentheexpressionofsignaltransducers-transcriptionactivators3andvascularendothelialgrowthfactorincutaneousmalignantmelanoma(P<0.001). Conclusion The signal transducers- transcription activators 3 may promote the formation of new blood vessels in the CMM by up- regulating the expression of vascular endothelial growth factor which was closely correlated to the tumor growth, invasion and metastasis．This study will provide new way for the targeted treatment of cutaneous malignant melanoma.

Cutaneous malignant melanoma; Signal transducers and transcription activators 3; Vascular endothelial growth factor; Immunohistochemistry

110016 辽宁 沈阳，辽宁省人民医院 (皮肤科:李银玲, 表贞淑, 杨 锎, 祝立丽;病理科:肖明明, 侯 慧, 景士兵)

李银玲(1978- )，女，辽宁沈阳人，主治医师，硕士研究生. 通信作者：景士兵，110016，辽宁省人民医院 病理科，电子信箱：mypathology@163.com

10.3969/j.issn.1673- 7040.2015.03.023

R

A

1673- 7040(2015)03- 0190- 03

2014- 12- 19)