区分高低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT—PCR方法的建立

孙春亮　赵敬慧　刘月　蔡锦顺

摘要：为了在临床上快速、有效区分高低致病性PRRSV，参考GenBank发表的代表性毒株，根据高致病性毒株Nsp2基因上有30个氨基酸不连续缺失的特点，设计并合成1对引物，扩增高低致病性PRRSV Nsp2基因的目的条带长度分别为644、734 bp，从而将二者区分开来。用本方法对长春及其周边地区送检60份病料进行盲检，检出10份高致病性PRRSV。并与N蛋白基因引物RT-PCR诊断方法进行比较，结果均一致，表明该方法准确性高。本研究所建立的RT-PCR方法为PRRSV在临床上的快速诊断和实验室流行病学调查提供了简捷的技术手段。

关键词：PRRSV；Nsp2基因；RT-PCR诊断；流行病学调查

中图分类号： S858.28 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0226-02

2006年以来，中国南方部分地区猪场暴发高热为特征的传染性疾病，并逐渐蔓延扩散到北方各地区，给养猪业带来了巨大的经济损失。这种传染性疾病后来被命名为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），该病具有传播速度快、发病率高、病死率高的特征，并且继发感染链球菌等，与伪狂犬等病毒混合感染增加了临床诊断的难度。因此，建立一种能够快速，有效、准确的检测方法在 PRRS 的防控上具有重要意义。经病原分离及分子流行病學分析，国内流行的高致病性毒株主要是由1种带有Nsp2基因部分缺失以及多个位点发生突变对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。

PRRSV基因组毒株间具有较高的遗传变异性，M蛋白在各毒株间比较保守，同型毒株间M蛋白序列同源性大于96%，欧洲、美洲型毒株间序列同源性在78%～81%之间[1]；其次N蛋白保守性较高，欧洲、美洲型毒株间的同源性在59%～63%之间，同基因型毒株之间的同源性可达 96%～100%[2]。GP5、GP3、NSP2是容易发生变异的3个蛋白，其中GP5变异程度最大，欧洲、美洲型毒株间GP5同源性仅为52%～55%[3]其次为GP3，同一毒株间同源性为 86%～98%，2个基因型毒株间GP3氨基酸同源性为54%～ 60%，GP3多数变异发生在N末端，2个基因型GP3 N末端35个氨基酸残基的一致性不到30%[4]。

在PRRSV基因组中非结构蛋白NSP2变异程度最显著，美洲型同型毒株间同源性约为80%，美洲型、欧洲型毒株间同源性仅为 40% 左右，NSP2 的中心区易变异，并且变异不仅表现为个别碱基的置换，还表现在缺失和插入上。 Gao等对PRRSV分离株HB-2 （sh）/2002的全基因序列测定分析表明，NSP2蛋白存在编码12个氨基酸的连续36个核苷酸的缺失，这是国内首次发现的NSP2蛋白存在缺失变异现象[5]。

本研究根据 Nsp2基因序列设计引物，该引物包含 Nsp2基因缺失序列，分别对高致病和经典毒株的基因片段进行特异性扩增，通过 RT-PCR 扩增目的基因片段长度的不同可将二者区分开来。试验结果表明，新建立的RT- PCR 鉴别方法可以达到快速、简捷、有效区分高致病性变异 PRRSV与经典型PRRSV的目的。

1 材料与方法

参考GenBank上多株PRRSV毒株序列，利用Primer Premier 5.0设计并合成1对引物，所设计这对引物覆盖Nsp2基因整个缺失区域。由于高致病性PRRSV变异株与低致病株相比发生90个核苷酸的缺失，所以高致病性株和经典株的预期扩增产物长度分别约644、734 bp。

上游引物：5′-CGAGCTTAAAGACCAGATGGAGGAG- 3′；下游引物：5′-CTTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT- 3′。

按照Simply P 总RNA提取试剂盒说明书，分别对PRRSV CC-13分离株RNA基因组进行提取，进行反转录。

临床送检样品来源长春及周边地区猪场疑似PRRS病死猪的组织病料（肺脏、脾脏、肾脏、子宫和淋巴结等），组织剪碎，在冰浴中匀浆，4 ℃静置一段时间（0.5～1.0 h），10 000 r/min 离心10 min取上清，提取RNA。取病料上清液100 μL到灭菌1.5mL离心管中，按照RNA提取试剂盒说明书提取病料RNA，进行反转录，制备cDNA，进行PCR扩增。

将PRRSV （CC-13株）、PCV2、CSFV、PRV病毒用合成的F/R引物进行PCR扩增。

用Marc-145细胞对PRRSV（CC-13株）进行病毒效价滴定，计算病毒TCID50，经测定病毒效价为105 TCID50/0.1 mL。然后依次稀释成10 000、1 000、100、10、1、0.1、0.01 TCID50，提取病毒RNA并制备cDNA，用建立的RT-PCR方法进行检测。

对上述的敏感性和特异性试验重复3次，以检验该方法的重复性情况。用建立的RT-PCR方法检测临床送检样品，鉴定结果与N蛋白基因引物RT-PCR鉴定结果进行对比。

2 结果与分析

对PRRSV CC-13株、PCV2、CSFV、PRV进行扩增，结果只有PRRSV CC-13株出现预期结果扩增出644 bp的目的片段，说明本方法特异性较好。根据扩增片段大小判断可知PRRSV CC-13株为高致病性PRRSV变异株，结果见图1。自1996年首次确定PRRSV在中国存在以来，针对PRRSV建立了很多种检测方法，主要包括普通RT-PCR、荧光定量RT-PCR、环介导等温扩增技术RT-LAMP、ELISA、胶体金、免疫荧光试验等。其中就有高灵敏度的检测方法如荧光定量RT-PCR、环介导等温扩增技术等，但这些检测方法价格高，操作技术要求严，不适合用于普通临床检测。ELISA、胶体金等检测方法操作容易，但检测灵敏度与重复性又受到质疑。简单、快速、准确的RT-PCR检测方法成为目前诊断的主要方法。

经1% 琼脂糖凝胶电泳观察，在0.01 TCID50处仍可看到特异性条带，结果表明，本方法敏感度可达0.1 TCID50（图2）。本方法具有很好的特异性，可以实现PRRSV的特异性扩增；敏感性试验表明，该方法检测的敏感度可达 0.1 TCID50，表明本方法的敏感性較高，可以较敏感地检测到样品中的PRRSV。重复性试验表明，重复3次检测结果基本一致，说明本方法的重复性较好。

对上述的敏感性和特异性试验重复3次，阳性情况以及扩增条带大小情况与上述结果一致。

用本试验建立的RT-PCR方法，对长春及周边送检的60份病料进行盲检，结果有10份病料为阳性，与研究中用针对N蛋白基因的引物进行RT-PCR检测结果相一致。从图3可看出，上述部分样品中分别位于5、9、11的3个样品的扩增片段约为644 bp片段，与图4中N蛋白基因引物鉴定结果基本一致，并且可以判断出这3个阳性样品为高致病性PRRSV毒株。本试验所建立的RT-PCR鉴别诊断方法，它不仅能够为流行病学研究提供辅助手段和方法，而且还能够为流行病学研究指引方向，在辨明毒株的类型前提下，可以有的放矢地开展相关研究。

3 结论

建立一种快速、准确区分高致病性PRRSV与低致病性PRRSV的RT-PCR方法，通过验证该方法可以应用于临床诊断，快速鉴别出高低致病性PRRSV毒株。

参考文献：

[1]Meng X J，Paul P S，Halbur P G，et al. Phylogenetic analyses of the putative M （ORF 6） and N （ORF 7） genes of porcine reproductive and respiratorysyndromevirus（PRRSV）：implicationfortheexistence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A. and Europe[J]. Archives of Virology，1995，140（4）：745-755.

[2]Magar R，Larochelle R，Dea S，et al. Antigenic comparison of Canadian and US isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using monoclonal antibodies to the nucleocapsid protein[J]. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne de Recherche Veterinaire，1995，59（3）：232-234.

[3]Suárez P，Zardoya R，Martín M J，et al. Phylogenetic relationships of European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） inferred from DNA sequences of putative ORF-5 and ORF-7 genes[J]. Virus Research，1996，42（1/2）：159-165.

[4]Murtaugh M P，Elam M R，Kakach L T. Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus[J]. Archives of Virology，1995，140（8）：1451-1460.

[5]Gao Z Q，Guo X，Yang H C. Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus[J]. Archives of Virology，2004，149（7）：1341-1351.