pH值响应聚乙二醇化壳聚糖基隐形纳米胶束的制备 及其载药性能

姚文杰，辛梅华，李明春，方江海

（华侨大学材料科学与工程学院，环境友好功能材料教育部工程研究中心，福建 厦门 361021）

近年来，可明显提高药物体内半衰期，增强药物靶向性及疗效的聚乙二醇（PEG）化隐形纳米胶束逐渐受到人们的重视[1]。PEG化隐形纳米胶束是在PEG化的基础上降低胶束粒径至100nm左右，从而进一步降低网状内皮系统对其识别和摄取能力，延长在血液循环滞留时间[2-3]。 Praneet等[4]制备了N-邻苯二甲酰基-3-mPEG-壳聚糖自组装纳米胶束，并以喜树碱为模型药物研究了药物包埋和释放行为。结果表明，在pH值为7.4的PBS模拟液中该聚合物具有较高稳定性和药物缓释性能，胶束平均粒径为200～267nm。Wang等[5]利用十八烷基季胺化赖氨酸对壳聚糖改性后（OQLS），分别接枝mPEG和FA（叶酸），制得mPEG-OQLS和FA-OQLS。将两者混合形成了具有主动靶向的隐形纳米微囊，其平均粒径达160nm，但产物仅溶于氯仿不溶于水，无法应用于疏水药物的包载。因此制备能水溶的PEG化双亲性聚合物胶束成为当前研究的热点。

李昆等[6]制备了水溶双亲性N-辛基化-N-mPEG化壳聚糖，并对产物包覆量子点进行研究，发现聚合物纳米粒子为球形，且分布较为均一，粒径为200nm左右。Jong等[7]制备了PEG化聚天冬酰胺衍生物，在PBS模拟液中pH值为7.4时，胶束稳定性高且具有缓释性能，在pH值为6.5时，出现突释现象，该研究为实现药物在人体的主动靶向释放提供了可能性。作者课题组[8]曾制备高取代度的N,N-双十二烷基壳聚糖，能溶于氯仿和四氢呋喃。烷基链取代度增加，载药量增加，临界胶束浓度和胶束粒径减小[9-10]。但高取代N,N-双烷基壳聚糖的疏水性强，而mPEG羧基化和卤化改性在壳聚糖的羟基上接枝率低[6，11]，不易形成水溶性双亲性衍生物。为此，本文提出一种新的方法，将mPEG经氯乙酸羧化改性后，通过酰化反应接枝到双烷基壳聚糖的羟基上，制备出高接枝度N,N-双烷基-3,6-O-mPEG-壳聚糖（PEDLCS）水溶性衍生物，合成路线见图1，并以酮洛芬为疏水模型药物，对产物在水中的自组装行为进行研究，为其在疏水药物增溶中的应用提供依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

FD-1B-50型冷冻干燥机（博医康实验仪器公司）；FLS920型全功能稳态/瞬态荧光光谱仪（Edinburgh Instruments）；Nexusu 470 型傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet）；Bruker Avance III 型（500 MHz）核磁共振波谱仪（Bruker）；Vario MICRO元素分析仪（Elementar）；ZEN3600纳米激光粒度及zeta电位分析仪（malvern）。

壳聚糖（CS，Mw=50kDa，DD=90.95%），浙江澳兴生物科技有限公司；月桂醛（95%），二氯亚砜（99%），聚乙二醇单甲醚（mPEG，Mn= 1000Da），阿拉丁试剂；十二烷基磺酸钠（SDS），NaBH4（99%），上海国药集团；氯乙酸（99%），天津市光复精细化工研究所；酮洛芬（KP），武穴市迅达药业；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 mPEG-COOH的合成

[12]方法，将10.0g mPEG溶于40mL 20% NaOH溶液中，搅拌1h，缓慢滴加氯乙酸水溶液（4.7g氯乙酸溶于5mL水中），60℃反应6h。用稀盐酸调节pH值至中性，旋蒸除水，得白色固体。干燥，乙醚洗涤，再将产物溶于少量氯仿中，冰乙醚沉析，抽滤得目标产物mPEG-COOH。

图1 PEDLCS的合成路线

1.3 N,N-双十二烷基-3,6-O-mPEG-壳聚糖的合成

首先采用作者课题组方法[8]合成油溶性的N,N-双十二烷基壳聚糖（DLCS）。再参考文献[13]方法，将7g mPEG-COOH溶于20mL氯仿中，冰浴下搅拌0.5h，回流管上接干燥管，缓慢滴加2mL二氯亚砜1h。再滴加DLCS的氯仿溶液（0.5g DLCS溶于20mL氯仿中），室温反应1h后60℃反应7h。旋蒸除氯仿后溶于丙酮，过滤，滤液浓缩后的产物溶于水，用透析袋在蒸馏水中充分透析，冷冻干燥得产物N,N-双十二烷基-3,6-O-mPEG-壳聚糖（PEDLCS）。

1.4 PEDLCS载酮洛芬胶束的制备

参考文献[10]的方法，准确称取0.1gN,N-双十二烷基-3,6-O-mPEG-壳聚糖溶解于50mL pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，平均分成5份。100mg酮洛芬溶于3mL乙醇中，按一定比例量取酮洛芬（KP）溶液分别加入上述PEDLCS水溶液中，室温超声30min，蒸馏水透析12h。12000r/min离心10min，0.45μm滤膜过滤，滤液冻干至恒重得载药胶束粉末，4℃保存备用。

1.5 载药量和包封率测定

取1.4节制备的载酮洛芬胶束溶于1mL的PBS缓冲溶液中。移取0.2mL胶束溶液于10mL容量瓶中，乙醇定容，12000r/min离心10min，取上清液在260nm测定吸光值A，根据酮洛芬乙醇溶液的线性方程A=72.902C+0.0205（R2=0.9994），C为酮洛芬胶束浓度，单位mg/mL，线性范围0～0.025 mg/mL，求得胶束内酮洛芬的质量。计算包封率和载药量。

式中，m1为加入的KP总质量；m2为胶束内KP的质量；m为载体的质量。

2 结果与讨论

2.1 产物的表征

2.1.1 产物的FTIR分析

图2 合成产物的FTIR图

采用KBr压片法，测得N,N-双十二烷基壳聚糖（DLCS）、聚乙二醇单甲醚（mPEG）、羧化改性聚乙二醇单甲醚（mPEG-COOH）、N,N-双十二烷基-3,6-O-mPEG-壳聚糖（PEDLCS）的红外光谱如图2所示。图中b、c分别为mPEG和mPEG- COOH的FTIR谱图，2870cm-1附近的吸收峰为聚 乙二醇重复单元（—CH2—CH2—O—）中C—H的伸缩振动峰，1100cm-1附近为mPEG中醚键C—O—C的伸缩振动峰；c与b相比，1723cm-1附近出现了羧基中的C=O伸缩振动峰[15]，说明mPEG已羧化改性。 a、d分别为DLCS和PEDLCS的FTIR谱图，d与a相比，d在2928cm-1、2860cm-1和721cm-1处出现同样的特征吸收峰，2928和2860cm-1处为甲基和亚甲基的C—H伸缩振动峰，721cm-1为n≥4的(CH4)n基团的骨架振动峰，说明长链烷基已接到壳聚糖上[8]。且b与d相比，d在1636cm-1、1458cm-1、1350cm-1和1100cm-1处出现了mPEG骨架的特征峰[11]，说明mPEG已接枝到DLCS上得到目标产物。

2.1.2 产物的1H NMR分析

图3 PEDLCS的1H NMR图

以D2O为溶剂测得PEDLCS的1H NMR图如图3，其中δ3.44～3.89为壳聚糖骨架上H3、H4、 H5、H6的质子峰。δ2.32为十二烷基与氨基相连的亚甲基的质子峰，δ1.2附近为十二烷基上亚甲基的质子峰，δ0.81为十二烷基的甲基质子峰，说明长链烷基已经接到壳聚糖的氨基上[5]。δ3.29为—O—CH3(d)中H(d)的质子峰，δ3.62为—CH2—CH2(e)—O—CH2—中H(e)的 质 子 峰，δ4.28为CH3O(CH2CH2O)z+1CH2(f)CO—中H(f)的质子峰，说明mPEG已经接枝到双烷基壳聚糖上[15]。由1H NMR谱图进一步说明已合成了目标产物PEDLCS。

2.1.3 产物的取代度测定

产物的元素分析及由C/N 摩尔比计算取代度[9]结果见表1。壳聚糖的脱乙酰度为90.95%，十二烷基取代度为1.89，烷基链取代度是已报道[9-10]的两亲性烷基壳聚糖衍生物的近2倍 ，疏水链取代度高有利于形成粒径较小的聚合物胶束[10]。mPEG接枝率为1.63，与文献报道的16.5%[4]和29%[11]mPEG相比，接枝度有较大的提高，mPEG的接枝率高可以增加产物的亲水能力使产物溶于水，并且大量mPEG的存在保障了所形成载药胶束的长循环功 能[1]。

2.1.4 产物的溶解性试验

称取0.1g产物于100mL溶剂中，观察溶解情况，结果见表2。壳聚糖（CS）只有在弱酸性条件下可以溶解，这是由于壳聚糖分子内和分子间的氢键作用。N,N-双十二烷基壳聚糖（DLCS） 只溶于四氢呋喃和氯仿而不溶于水，N,N-双十二烷 基-3,6-O-mPEG-壳聚糖（PEDLCS）不仅能溶于酸性、中性和碱性水溶液中，而且能溶于除乙醚之外 的大部分有机溶剂，可见mPEG链的高接枝率拓宽了目标产物PEDLCS的溶解性能，是一种少有的两亲性聚合物。

表1 产物的元素分析结果及取代度

表2 原料及产物的溶解性

2.2 产物的载药性能以及载药胶束的pH值响应性

2.2.1 临界胶束浓度

以芘为荧光探针，采用稳态荧光法测定N,N-双十二烷基-3,6-O-mPEG-壳聚糖（PEDLCS）的临界胶束浓度（CMC）[14]。配制一系列含不同浓度芘的PEDLCS水溶液，选择激发波长335nm，扫描范围350～450nm，狭缝宽度0.6nm测其稳态荧光光谱，进一步计算并绘制lgC～I372/I383关系曲线如图4所示。分段做曲线的切线，切线的交点对应的浓度即为PEDLCS的CMC值0.1170 mg/mL，比文献[4]报道的mPEG化壳聚糖基药物载体材料的CMC值28μg/L小，CMC值小有利于在体内循环被稀释时胶束的稳定存在。

2.2.2 载药胶束粒径、Zeta电位及包封率和载药量的测定

按照实验部分1.4节操作，制备N,N-双十二烷基-3,6-O-mPEG-壳聚糖自组装载酮洛芬胶束。测得不同KP/PEDLCS投料比的PEDLCS载药胶束的载药量、包封率、粒径和Zeta电位见表3，可见随着KP/PEDLCS投料比从0.6∶1增大到1.4∶1，包封率从79.85%下降到45.88%，载药量从32.39%增大到39.11%。载药胶束的粒径随着载药量增大呈现先减小再增大的趋势，Zeta电位的绝对值都在30 mV左右，说明载药胶束都具有良好的稳定性。粒径较小有利于实现胶束在体内的隐形性，达到长循环，因此选择最佳KP/PEDLCS投料比0.8∶1制备载药胶束，平均粒径为155.1nm，此时包封率为65.78%，载药量为34.48%；与文献报道的200～267nm[4]、220.2nm[15]和167.5nm[5]相比具有较小的 粒径。可见，引入mPEG亲水基团不仅使产物可以形成稳定胶束，对KP有较高的包封率和载药量，而且形成的聚合物胶束粒径较小，有望成为壳聚糖基隐形纳米胶束。

图4 芘的荧光发射强度比（I372/I383）与 PEDLCS浓度关系曲线

表3 PEDLCS载酮洛芬聚合物胶束的性能参数

2.2.3 载药胶束在不同pH值条件下的响应性

采用KP/PEDLCS质量比为0.8∶1，按照1.3节制得的载药胶束具有良好的pH值响应性。在pH值5.5时胶束呈絮凝状，缓慢滴加PBS缓冲溶液，随着pH值的逐渐增大，在6.0左右凝聚物快速消失，继续增大pH值胶束呈现透明状；再次调节pH＜6.0时，凝聚物又迅速出现，可见PEDLCS载药胶束呈现出较优越的pH值敏感性。这可能是由于产物中氮双烷基的存在，在pH值7.4～5.5反复调节时，聚合物胶束质子化和去质子化作用的结 果[7]。

把KP/PEDLCS=0.8∶1制得的载药和空白胶束复溶于不同pH值的PBS溶液中，用纳米激光粒度及Zeta电位分析仪测定粒径和Zeta电位，结果见表4。可见，随着pH值从7.4降低到6.5，空白胶束粒径变大，粒径分散指数从0.155增大到0.359，Zeta电位的绝对值降低；载药胶束的粒径由158.4nm增大到345.8nm，粒径分布由单峰变成双峰（图5），粒径随pH值降低而增大，并且Zeta电位的绝对值由31.5降低到7.95。以上实验说明随着pH值的降低，载药胶束和空白胶束的稳定性降低，粒径有增大的趋势，PEDLCS具有pH值响应性，其响应范围符合癌细胞微环境（pH值7.2～6.0）[16]。

表4 不同pH值条件下空白胶束和载药胶束的性能参数

图5 载药胶束在pH值为7.4(a)和6.5(b)的粒径分布

3 结 论

mPEG先用氯乙酸羧化改性，再通过酰化反应接枝到双烷基壳聚糖上，制得高取代度的N,N-双十二烷基-3,6-O-mPEG-壳聚糖（PEDLCS）衍生物，其中烷基取代度为1.89，mPEG接枝度为1.63。PEDLCS溶于水和除乙醚外的大部分有机溶剂，在水溶液中能自组装形成粒径较小的稳定胶束，较小的粒径和较高的mPEG接枝度有利于实现胶束在人体的长循环，从而达到隐形性。pH值响应范围符合癌细胞微环境（pH值7.2～6.0），有望成为具有pH值响应主动靶向的隐形纳米胶束。

参 考 文 献

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