马唐生防真菌ZC201301的筛选及其致病力测定

李健+李美+高兴祥+房锋

摘 要：从发病马唐叶片上分离得到菌株ZC201301，对其培养特征和16S rDNA序列比对分析后，确认该菌株为厚垣孢镰刀菌。盆栽试验表明，该菌株分生孢子液对马唐有很好的防治效果，鲜重防效达90.2%;对反枝苋、播娘蒿效果也较好，鲜重防效分别达到72.8%和50.7%;但对狗尾草和稗草防效较差，仅为27.9%和30.0%。进一步分析表明，菌株ZC201301对马唐的致病力受接种孢子浓度、接种温度等因素影响。作物安全性试验表明，该菌株分生孢子液对小麦、大豆、玉米均相对安全。以上结果表明，菌株ZC201301有开发为生物除草剂的潜力。

关键词：厚垣孢镰刀菌;ZC201301;生物防治;马唐;作物安全性

中图分类号：S476.12  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2015）06-0093-04

Isolation and Pathogenicity Detection of Biological

Control Fungi ZC201301 to Digitaria sanguinalis

Li Jian， Li Mei*， Gao Xingxiang， Fang Feng

（Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Shandong Key Laboratory of Plant Virology， Jinan 250100， China）

Abstract Strain ZC201301 was isolated from diseased Digitaria sanguinalis leaves. According to its culture characters and 16S rDNA sequence analysis， the strain was identified as Fusarium chlamydosporum. The pot experiment showed that the fresh weight control effects of conidium liquid on Digitaria sanguinalis， Amaranthus retroflexus， Descuminia Sophia were better， which were 90.2%， 72.8%， 50.7% respectively. The control effects on Setaria viridis and Echinochloa crusgalli were only 27.9% and 30.0%. The further analysis showed that the pathogenicity of strain ZC201301 to Digitaria sanguinalis was limited by spore concentration， inoculation temperature and other factors. The crop safety analysis showed that the strain ZC201301 was safe to Triticum aestivum， Glycine max， Zea mays. In summary， the ZC201301 might be a potential microbial herbicide.

Key words Fusarium chlamydosporum; Biological control; Digitaria sanguinalis; Crop safety

马唐（Digitaria sanguinalis）是世界上公认的分布广泛的18种恶性杂草之一[1]，主要危害小麦、大麦、玉米、水稻、高粱等禾本科作物，也是蔬菜田常见的主要杂草[2];马唐环境适应能力强，生长迅速，消耗地力，目前主要依赖人工和化学防除[3];在中国，由马唐引起的作物损失占秋熟旱作粮田杂草总损失的一半以上[4]。

近年来，化学除草剂的长期使用引起抗性杂草的产生和环境污染，同时伴随人们环保意识逐渐增强，对农药残留低的绿色食品的需求越来越高[5]。因此，研制生物除草剂进行目标杂草的防除，已成为生产上的迫切需求。我国生物除草剂研制时间较早，20世纪60年代中期研制并推广的“鲁保1号”菌剂对当时大豆菟丝子的防治起到了重要作用[5]。近年来，我国杂草研究机构在马唐-画眉草弯孢[6]、稗草-新月弯孢[7]、阔叶杂草-出芽短梗霉[8]等菌草体系的研究中取得了进展，但目前我国生物除草剂登记产品仍然较少，而全世界已经开发的生物除草剂产品已经有20余种[9]。

微生物除草剂应具备对目标杂草强致病性和对作物安全两大特点[10]。但是微生物除草剂在使用过程中又受到来自于环境条件的限制，往往只能在一定的环境范围和区域内发挥防治作用。本实验室于2013年对山东省主要杂草病原真菌进行调查和分离，并从采自济南的感病马唐叶片上分离得到1株具有强致病力的菌株ZC201301（专利公开号：CN104250620A），对其进行形态学和分子生物学鉴定、生防效果和作物安全性评估，以期为其进一步深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物：马唐（Digitaria sanguinalis）、反枝苋（Amaranthus retroflexus）、播娘蒿（Descuminia sophia）、狗尾草（Setaria viridis）和稗草（Echinochloa crusgalli）等杂草种子均为本实验室采集并保存。玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）和小麦（Triticum aestivum）种子均购自种子公司。endprint

试剂与培养基：次氯酸钠、CTAB、氯仿·异戊醇、吐温80等购自上海生物工程有限公司;Taq酶等PCR相关试剂购自日本Takara 公司。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar， PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、水1 000 mL。

1.2 病原菌的分离纯化

从山东省济南市采集感病的马唐叶片，放于信封内，直接用于病原菌分离或4℃保存。剪下病叶的病健结合部位，无菌水冲洗2次， 2%（V/V）次氯酸钠溶液表面消毒6 min，70%（V/V）乙醇表面消毒1 min，无菌水漂洗3次后将这些叶片组织转移到空的灭菌培养皿内，以上步骤均在超净工作台内完成。待叶片组织吹干后置于PDA培养基上，25℃培养箱培养至长出菌落，挑取部分菌丝至新的PDA培养基内培养至产孢，经过单孢子分离得到菌株，并编号。

1.3 菌株的鉴定

将菌株ZC201301在PDA平板上培养10 d，观察其菌落形态。同时洗下分生孢子，显微镜下观察，按照真菌鉴定手册进行初步鉴定[11]。CTAB法[12]提取菌株的基因组DNA，用引物ITS4 （5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）和ITS5 （5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3′）进行PCR扩增。PCR 反应条件为：94℃预变性4 min;94℃变性 1 min，53℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共29个循环;最后 72℃延伸 10 min。将PCR产物回收测序。利用NCBI Blast对所测序列进行比对分析，利用Clustal X 2.0和Mega 6软件构建系统发育树。

1.4 ZC201301菌株致病力影响因素测定

25℃、光照/黑暗12 h/d交替条件下，ZC201301菌株在PDA培养基上培养14 d后，收集孢子并配制成浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液（含0.1%吐温80）。

将浓度为1×108个/mL和1×105个/mL的孢子悬浮液用手持小喷壶分别喷施于2～3、4～5叶期的马唐植株上，黑暗条件下放于不同温度和湿度人工气候箱内48 h，之后持续光照条件下培养，14 d后记录致死株数和称量植株鲜重，计算鲜重防效，以喷施0.1%吐温80的植株为对照，每处理重复3次。

1.5 寄主范围测定

收集并配制浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液喷施于2～3叶期反枝苋、播娘蒿、狗尾草、稗草（以上杂草种子均采自山东省济南市）等杂草上;25℃、黑暗保湿培养48 h，之后持续光照培养。接种14 d后记录发病程度和鲜重防效，以喷施0.1%吐温80的植株为对照，每处理重复3次。

1.6 ZC201301作物安全性测定

培养ZC201301菌株并收集分生孢子，将浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液喷施于3～4叶期的小麦、大豆、玉米植株上，培养方法同1.5。接种14 d后记录发病程度和鲜重防效。参考李永龙文献[8]，按以下标准记载发病程度：NS 表示无症状（一直无病斑，植株正常生长）;LS 表示有轻微反应（初期叶片分布零星斑点，14 d后鲜重不受抑制）;MS 表示中等感病（叶面出现较多病斑，14 d后鲜重受到抑制）;SS 表示严重感病（叶片病斑连成一体，14 d后鲜重受到严重抑制）。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与鉴定

ZC201301菌株在PDA培养基上培养10 d后，菌落质地紧密，边缘规则，呈厚絮状，生长初期呈白色，逐渐产生粉红色色素。培养过程中产生两种孢子，一种为镰刀形大孢子，一种为类椭圆形厚垣孢子。提取基因组DNA，克隆16S rDNA基因序列，回收测序后进行序列分析。表型观察和系统发育树（图1 ）分析表明，ZC201301菌株为厚垣孢镰刀菌（Fusarium chlamydosporum）。

图1 ZC201301进化树分析

2.2 保湿时间和接种浓度对致病力的影响

由表1可以看出，湿度对菌株ZC201301影响较大，喷接相同浓度孢子液，90%湿度下马唐受抑制率明显高于40%湿度条件下。而在相同湿度条件下，喷施不同浓度孢子液的马唐受抑制率存在一定差别，但是差异不显著（P<0.05）。

表1 湿度和接种浓度对菌株ZC201301

致病力的影响

湿度

（%）

1×105个/mL

致死率（%） 鲜重防效（%）

1×108个/mL

致死率（%） 鲜重防效（%）

90 30.1±11.1b 86.7±4.1a 45.2±5.2b 90.2±1.4a

40 15.2±6.2b 41.6±6.8a 17.8±2.8b 51.5±0.7a

注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后不同字母表示在0.05 水平上差异显著。

2.3 接种温度和接种时期对致病力的影响

由表2可以看出，菌株ZC201301对马唐的致病力受接种时期和温度影响较大。相对于22℃的接种条件，30℃下菌株ZC201301对相应叶期的马唐防效均显著下降。而在相同接种温度下，菌株ZC201301对2～3叶期马唐的防效要远好于4～5叶期马唐。

表2 接种温度和时期对菌株ZC201301

致病力的影响

温度

（℃）

2～3叶期

致死率（%） 鲜重防效（%）

4～5叶期

致死率（%） 鲜重防效（%）endprint

22 43.2±3.2a 88.6±2.9a 18.7±2.3a 68.4±5.7a

30 28.5±5.1b 80.2±2.1b 3.6±3.3b 27.9±4.8b

注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同列数据后不同字母表示在 0.05 水平上差异显著。下同。

2.4 菌株ZC201301对不同杂草致病力分析

菌株ZC201301孢子液喷施2～14 d后对反枝苋、播娘蒿、狗尾草、稗草的平均鲜重防效分别达到72.8%、50.7%、27.9%、30.0%，对反枝苋防效最好，播娘蒿次之，二者之间差异显著，均显著优于狗尾草和稗草（表3）。

表3  菌株ZC201301对不同杂草的生物防效

杂草种类

致死率（%）

鲜重防效（%）

反枝苋Amaranthus retroflexus 49.6±3.4 72.8±1.3a

播娘蒿Descuminia sophia 0 50.7±2.6b

狗尾草Setaira viridis 10.7±5.0 27.9±2.7c

稗草 Echinochloa crusgalli 0 30.0±5.3c

2.5 作物安全性分析

试验结果（表4）表明，菌株ZC201301孢子液对供试作物相对安全，大豆（中黄57、鲁豆10）和小麦（济麦22、山农15号）无致病性（NS），玉米（鲁单981、登海6702）表现为轻微反应（LS），接种初期叶片可见少量黑点，14 d后病斑未增多或扩展，鲜重未受到抑制。

表4 作物安全性试验

作物种类

株高抑制率（%）

感病程度

大豆

中黄57 0 NS

鲁豆10 0 NS

小麦

济麦22 0 NS

山农15号 0 NS

玉米

鲁单981 3.5±2.2 LS

登海6702 4.3±1.9 LS

3 讨论与结论

随着人们生态意识的增强，微生物除草剂逐渐成为当前除草剂研制和开发的热点[13]。本试验菌株ZC201301是从当地罹病马唐植株上采得，未经任何基因修饰，环境适应性强，使用时不会造成生态环境的隐患。经培养观察和分子生物学鉴定，将该菌株归为厚垣孢镰刀菌。该菌在PDA培养基上易于培养，产生紧密、呈厚絮状菌落。该菌株生长温度范围广，生长速度快，产孢量高，具备开发为杂草生防菌的基础条件。

不同于化学除草剂，真菌除草剂对环境条件的要求较为苛刻[14]。室内生测试验表明，菌株ZC201301对马唐的致病力受到湿度的影响，在接菌后湿度为90%条件下，其对马唐的鲜重防效达到90.2%;而在湿度为40%条件下仅为51.5%;相对于湿度对菌株ZC201301致病力的影响，接种孢子液浓度对其致病力影响较小。这表明菌株ZC201301孢子致病力较强，仅需在较低的浓度下就能达到防治效果，但是其致病力的发挥需要较高的湿度条件，受到一定环境因素的限制。进一步的研究显示，菌株ZC201301对接种温度有较高要求，相对于30℃条件，22℃接种条件下生防效果更佳;相同接种温度下，对2～3叶期马唐防效明显好于4～5叶期。这可能是由于高温条件下马唐生长较快，而菌种产生致病效果需要一定时间，这在一定程度上限制了菌株生防效果的发挥。同时作物安全性试验表明该菌株对小麦（济麦22）、大豆（中黄57）和玉米（鲁单981）安全，表明该菌有望作为生物除草剂候选菌。

参 考 文 献：

[1] Webster T H， Coble H D. Changes in the weed species compo-sition of the Southern United States： 1974-1995[J]. Weed Technology， 1997， 11： 308-317.

[2] 石鑫，沈国辉， 李伟芳. 蔬菜田杂草及其化学防除[M]. 北京：中国农业科学技术出版社， 1992： 161-166.

[3] 温广月，钱振官，李涛，等.马唐生物学特性初步研究[J].杂草科学，2014，32（2）：1-4.

[4] 朱云枝， 强胜. 真菌菌株QZ-2000对马唐（Digitaria sanguinalis）致病力的影响因子[J]. 南京农业大学学报， 2004， 27（2）： 47-50.

[5] 高昭远， 干静娥. 菟丝子的生物防除——“鲁保1号”的研究进展[J]. 生物防治通报， 1992， 8（4）： 173-175.

[6] Zhu Y Z， Qiang S. Isolation， pathogenicity and pafety of Curvularia eragrostidis isolate QZ-2000 as a bioherbicide agent for large crabgrass （Digitaria sanguinalis） [J]. Biocontrol Science and Technology， 2004， 14： 769-782.

[7] 韦韬， 李静， 倪汉文， 等. 稗草生防菌新月弯孢菌株 J15（2）的生物学特性[J]. 中国生物防治， 2009， 25（1）： 54-59.

[8] 李永龙， 程亮， 朱海霞， 等. 出芽短梗霉菌菌株PA-2的除草活性及对作物的安全性[J]. 中国生物防治学报， 2014， 30（2）： 232-238.

[9] 强胜， 陈世国. 生物除草剂研发现状及其面临的机遇与挑战[J]. 杂草科学， 2011， 24（1）： 1-6.

[10]马娟， 董金皋. 微生物除草剂与生物安全[J]. 植物保护， 2006， 32（1）： 9-12.

[11]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 北京： 科学出版社， 1982.

[12]张颖慧， 魏东盛， 邢来君， 等. 一种改进的丝状真菌DNA提取方法[J]. 微生物学通报， 2008， 35（3）： 466-469.

[13]赵航， 周勇军， 刘小川， 等. 生物除草剂剂型研究进展[J]. 植物保护， 2005， 31（5）： 5-8.

[14]强胜.生物除草剂研究概况[J].杂草科学， 1996（2）：7-11.endprint