小麦白粉病生防菌拟诺卡氏菌属TMG—8菌株的筛选研究

曹远银+王婉琳+申璐岚

摘要：为更好地利用生防菌防控小麦白粉病危害，从不同省份、不同生态环境中采集52份土样，用稀释分离法得到150株菌株，通过小麦白粉孢子萌發抑制试验、小麦离体叶片药效试验及温室苗期药效试验筛选得到1株对小麦白粉病抑制作用较强的生防菌株TMG-8。采用16S rDNA序列分析法结合部分生化测定试验对生防菌TMG-8进行初步鉴定，并采用抗生素抗性标记法测定生防菌TMG-8的定殖能力。初步鉴定菌株TMG-8为拟诺卡氏菌属；生防菌可在叶面上短暂定殖，在小麦叶片上的定殖量为下部>中部>上部，在小麦苗上的定殖量为根部>茎部>叶部；菌株 TMG-8可在土壤中短期稳定定殖，其含量随着时间逐步增加并趋于稳定，但增加幅度不大；无论是浸根处理还是灌根处理，生防菌都能在小麦苗上定殖，定殖量为根部>茎部>叶部，灌根处理比浸根处理含菌量多。

关键词：小麦白粉病；生物防治；拟诺卡氏菌属；定殖能力

中图分类号：S435.121.4+6 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2017）01-0095-04

小麦白粉病是由禾本布氏白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）引起的一种世界性病害，在世界各产麦区均有发生，是影响小麦生长发育的主要病害之一[1]。近年来，随着部分地区年降水量增多[2]、冬季温度升高[3]、耕作制度变化以及受菌种变异、品种繁杂等因素的影响[4]，我国小麦白粉病的发生与危害日趋严重，几乎蔓延至全国所有麦区，在很多地区已从次要病害上升为主要病害，成为小麦生产中发病面积大、危害损失严重的常发性病害。

化学防治是小麦白粉病防治的重要措施，具有防治效果好、收效快、使用方便、受季节性限制较小、适于大面积使用等优点，但近年来随着药剂防治的一些弊端如农药残留、病菌产生抗药性的出现，人们急需寻找一种安全、高效、无污染的生物农药来解决这些问题[5]。目前，利用有益微生物防治农业植物病害具有良好的应用前景。国内外一些学者在生防菌的研究和开发方面做了大量工作并取得了良好的成果。据田小卫等报道，链霉菌属次生代谢产物在质量浓度为6 000 mg/L时，对小麦白粉病的保护和治疗效果分别为76.13% 和70.78%[6]。于基成等研究测定了植物源杀菌剂对小麦白粉病的保护和治疗作用，防效分别为66.78%和73.33%，均优于其他生物药剂[7]。张晶等筛选出的放线菌DL26和PJ2对小麦白粉病抑制能力较强，病情指数与三唑酮处理差异不显著，防治效果分别达74.43%和70.01%[8]。Hajlaoui等报道Sporothrix flocculosa对小麦白粉病有一定的防治作用[9]，Timothy 等测定了S. flocculosa对小麦白粉病的防治效果，检测结果表明其与吗菌灵和硫磺对白粉菌有一样的防效[10]。美国Agraquest公司曾利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）QST703株系生产出生物农药产品[10]。本研究报道了从山西、山东、河南、甘肃、南京、黑龙江、辽宁等省份和市区不同生态环境的52份土样中分离筛选得到的生防菌株TMG-8，明确该菌株对小麦白粉病有良好的防效，并观察其培养特征，测定部分生化特性，结合16S rDNA序列分析进行初步鉴定，同时研究了它在小麦上的定殖能力，为研制防治小麦白粉病的生防制剂打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤：分别于2010—2012年，从山西、山东、河南、甘肃、南京、黑龙江、辽宁等省份和市区不同生态环境里采集土样52份。

供试病原菌：小麦白粉病菌由沈阳农业大学小麦病害实验室提供。

供试培养基：分离培养基采用马铃薯琼脂糖固体（PDA）培养基、马铃薯琼脂糖液体（PDB）培养基、牛肉膏蛋白胨固体（NA）培养基、牛肉膏蛋白胨液体（NB）培养基、高氏1号固体培养基、高氏1号液体培养基、1.5%琼脂液体培养基。

1.2 土壤生防菌分离与筛选

1.2.1 生防菌分离 采用土壤稀释分离法，制备不同浓度梯度的土壤菌悬液（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），依次分别接入PDA、NA和高氏1号培养基中，置于28 ℃下恒温培养3～5 d，挑取形态、颜色等培养性状不同的单菌落转接，再经划线培养、纯化后转接到相应的液体培养基中，28 ℃下130 r/min培养4～5 d，离心收集上清液。

1.2.2 孢子萌发抑制试验 将菌株发酵液分别与1.5%融化状态的琼脂培养基以1 ∶1混合，取500 μL滴加到载玻片上，将待测定的小麦白粉菌孢子均匀抖落到培养基上，于 18 ℃ 无光条件下培养48 h，以含1.5%琼脂的无菌水（1 ∶1）培养基上的孢子萌发率作对照，以1 g/L 15%的三唑酮可湿性粉剂为对照药剂。每处理重复3次，镜检并计算孢子萌发抑制率。

1.2.3 小麦离体叶药效试验[11-12] 选取萌发抑制率较高的菌株进行离体药效试验。采用三点法接种白粉菌于离体苗期小麦叶片上，待肉眼可见白粉菌侵染时，将10 mL发酵液均匀喷雾在叶片上，同时以1 g/L 15%的三唑酮可湿性粉剂为对照药剂。将处理的小麦叶片放在室温（18～20 ℃）光照培养，待清水对照充分发病时进行调查（约10 d）。

1.2.4 温室盆栽苗期药效试验[11-12] 将离体叶片试验药效好的菌株再次进行盆栽苗期药效试验。待小麦长到2叶1心时接种小麦白粉病菌（在各处理区域均匀摆放3盆已经充分发病的盆栽小苗），用1 g/L 15%的三唑酮可湿性粉剂为对照药剂，待病菌侵染发病后喷洒药剂，药剂均采用菌株发酵液原液（菌量控制在106 CFU/mL），喷药剂量为15 mL/盆，在施药后1 d按照小麦白粉病病害分级标准调查病情指数，然后每隔5 d 调查1次，连续调查4次，并计算防效。

1.3 生防菌株16S rDNA序列分析

生防菌DNA的提取采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式细菌基因組DNA抽提试剂盒（型号：SK8255）方法进行。采用细菌鉴定通用引物1（27F和1 492R）和细菌鉴定通用引物2（7F和1 540R）进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，10×Buffer（加Mg2+）2.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，Taq DNA polymerase 0.5 μL，基因组DNA（20～50 ng/μL）0.5 μL，ddH2O 20 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环。PCR产物的纯化与回收参照生工生物工程（上海）股份有限公司SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（型号：SK8131）说明书，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测得基因在GenBank中进行Blast同源序列检索，并用MEGA 4.0软件对所得序列构建系统发育进化树。

1.4 生防菌部分生化特性测定[13]

测定菌株明胶液化、纤维素分解、牛奶分解、淀粉水解及硫化氢产生的生化特性。培养基配制参照《常见细菌鉴定手册》[14]。培养基置于28 ℃下培养3～15 d。

1.5 生防菌定殖能力测定[15-17]

1.5.1 菌株抗生素标记 将培养48 h的生防菌菌株用无菌水制成悬浮液，接入含有一定量的抗生素（浓度为20 μg/mL）的抗性平板上，以不加抗生素的平板为对照，筛选出菌株不能生长的平板，利用该培养基中含有的抗生素对生防菌株进行标记。将菌株接种于抗生素浓度为20 μg/mL的高氏1号培养基中，逐步增加抗生素浓度筛选出能在含500 μg/mL抗生素的高氏1号培养基上稳定生长且形态特征与原菌株一致的突变菌株。

1.5.2 生防菌在叶片上定殖能力试验 将标记后的生防菌发酵液均匀喷洒在小麦叶片上，立刻取上、中、下部叶片，分离并记录初始菌量，观察其能否在叶片上定殖。以后每隔5 d分离1次，计算每克叶上的含菌量，记录菌量变化。

1.5.3 生防菌在土壤中定殖能力试验 将标记后的生防菌发酵液作为菌悬液备用。4.5 kg土壤灭菌装入花盆中，将 10 mL 发酵液均匀喷洒于土壤中，并喷洒适量的无菌水，使土壤保持湿润，拂去表土，采用三点取样法取土，测每克土含菌量，记录初始菌量。以后每隔7 d分离1次，计算每克土的含菌量和菌量变化。

1.5.4 菌液浸根后的定殖情况 小麦种子经表面消毒后在培养箱中催芽，等种子发芽后用标记生防菌发酵液浸根1 d，播种于无菌土壤中。15 d后开始分离小麦（根、茎、叶）上的生防菌，以后每隔10 d分离1次，计算每克根、茎、叶中的含菌量，记录标记菌数量的变化情况。

1.5.5 菌液灌根后的定殖情况 小麦种子表面消毒播种于花盆中，待长到1心1叶时，向花盆中注入20 mL标记菌发酵液，15 d后开始分离根、茎、叶上的生防菌，以后每隔10 d计算每克根、茎、叶中的含菌量，记录标记菌数量的变化。

2 结果与分析

2.1 土壤生防菌的分离与筛选

采用稀释分离法分离得到菌株150株，其中真菌65株，细菌49株，放线菌36株；再加上2010—2011年实验室分离得到的放线菌菌株100株，共250株用于小麦白粉病潜在生防菌的筛选。通过孢子萌发试验共得到6株（放线菌5株，真菌1株）对小麦白粉菌孢子萌发有抑制作用的生防菌株，其中生防菌株TMG-8对小麦白粉菌孢子萌发抑制作用较强，抑制率为90.0%。对照组三唑酮可湿性粉剂对孢子萌发抑制率为97.8%。

对生防菌进行离体叶药效筛选试验。结果表明，菌株TMG-8的防效是73.8%，1 g/L 15%三唑酮的防效为85.9%，所以该菌株对小麦白粉病具有良好的防效。

温室盆栽试验结果（表1）表明，菌株TMG-8的防效在喷药后1～15 d内稳定在63.58%～73.98%之间，三唑酮则稳定在85.30%～95.33%之间。在经过TMG-8处理后的白粉病病情指数在1～10 d内上升幅度很小，能够维持在较低较稳定的状态（图1）。在15 d时，生防菌防效有所降低，这说明菌株在短时间内对小麦白粉病菌有良好的抑制效果，并且有短暂的持效期。

2.2 生防菌株16S rDNA序列分析结果

对菌株TMG-8进行PCR扩增，结果得到约1.5 kb的PCR产物（图2）。菌株TMG-8的16S rDNA序列长度为 1 402 bp，将菌株序列在GenBank中进行Blast比对（表2），结果表明，菌株TMG-8与NCBI登录号为JF895817.1的拟诺卡氏菌属链孢拟诺卡氏菌（Streptomyces sp. GxW1）同源性最高，高达100%（图3）。

2.3 生防菌株培养特征及生化特性测定结果

菌株TMG-8在高氏1号培养基上生长良好，菌落呈粉色，培养期菌落表面光滑且有明显的轮纹，菌落呈圆形，随着培养时间的延长，培养基近菌落周围开始出现明显的透明现象。

菌株TMG-8生化特性见表3。结果表明，菌株能够使明胶液化，可以使牛奶石蕊培养基先凝固后胨化，能够分解纤维素，可以产生H2S，并能够水解淀粉。

2.4 生防菌定殖能力测定结果

经天然抗药性检测，生防菌TMG-8对硫酸链霉素不具有抗性，因此选用硫酸链霉素对其进行标记。

由表4可知，一般在小麦上部叶片的含菌量小于中部，中部小于下部。生防菌可以在叶面上短暂存在，在15 d时，中部和下部叶片含菌量只有102数量级。从表4中可以看出，在5～10 d 之间，生防菌可以保持103～104的数量级。

由表5可见，菌株TMG-8都可以在土壤中短期稳定定殖，在土壤中的含量随着时间逐步增加并趋于稳定，但增加的幅度并不大，前后相差1个数量级，为108～109数量级，所以菌株TMG-8可以在土壤中短期定殖。

通過生防菌TMG-8在小麦上的定殖试验（表6）可以得出，无论是浸根处理还是灌根处理，菌株TMG-8都能在小麦苗上定殖，定殖量为根部>茎部>叶部。TMG-8经灌根处理后，根部、茎部和叶部含菌量均为先增加后减少并逐步趋于稳定；灌根处理55 d后，2株放线菌在根、茎、叶中的含量都还在102数量级上，且菌株TMG-8含量变化比较稳定，上下波动不大。使用灌根和浸根处理均能使菌株TMG-8定殖，但是灌根处理放线菌的含量比浸根处理多。

3 结论与讨论

本研究从各省份不同生态环境中采集多份土样，经小麦白粉菌孢子萌发抑制试验、小麦离体叶片药效试验、温室盆栽苗期试验等层层筛选，得到了1株生防菌TMG-8，该菌在短时间内对小麦白粉病有良好的抑制效果，并且有短暂持效期。孢子萌发抑制试验中，菌株TMG-8对小麦白粉菌孢子萌发的抑制率为90.0%；离体叶片试验中，菌株TMG-8的防效是73.8%；温室盆栽苗期试验中，菌株TMG-8的防效在喷药后的1～10 d内稳定在63.58%～73.98%之间，具有一定的生防潜力以及应用价值。根据16S rDNA序列分析比对结果，初步鉴定菌株TMG-8属于拟诺卡氏菌属。通过对其部分生化特性测定可知，菌株TMG-8能够向胞外分泌蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶，还能分解含硫氨基酸产生H2S。

本试验选用的抗生素抗性标记法具有快速、简便且成本低的优点，此方法不会导致原始菌株的遗传稳定性以及其他重要特性的变异与丧失[18]。通过试验可知，生防菌可在叶面和小麦苗上短暂存在，在小麦叶片上的定殖量为下部>中部>上部，在小麦苗上的定殖量为根部>茎部>叶部。在 5～10 d之间，可以保持103～104数量级，这与其生防效果在5～10 d相对稳定一致。菌株TMG-8可在土壤中短期稳定定殖，在土壤中的含量逐步增加并趋于稳定，但增加的幅度并不大，前后相差1个数量级，为108～109数量级。无论是浸根处理还是灌根处理，菌株TMG-8都能在小麦苗上定殖，定殖量为根部>茎部>叶部。使用灌根和浸根处理均能使放线菌定殖，但是灌根处理菌的含量比浸根处理多。这与先前报道有相似之处，如姚佳等研究HD8、CS4、YJ1、BC32在油菜根际土壤中短期定殖，HD8在土壤中含量是先升高后降低，数量最多达到108数量级；YJ1施入土壤后，其含量一直上升，且研究4株放线菌在油菜苗上定殖时，灌根处理比浸根处理分离得到的放线菌数量要多[19]。

植物病害的生物防治受植株、病原菌、生防菌以及环境等多方面因素的影响。由于放线菌在叶片和苗上的定殖容易受环境和雨水冲洗等多方面的影响，所以放线菌只能在叶片上短暂存在。本研究在室内环境下测定菌株TMG-8对小麦白粉病有一定的防效，但要想开发成为生防制剂还需研究其田间环境下的防治效果以及菌株TMG-8对土壤根际酶的影响。

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