板蓝根多糖的化学分离及其免疫增强活性的研究

徐艺铨

(江阴市中医院 江苏无锡 214400)

板蓝根是一种重要的清热解毒药物,具有较好的抗病毒效果,其对特异性免疫和非特异性免疫都有一定的促进作用,再有,板蓝根多糖在抑制炎症反应相关基因表达、防治炎症疾病方面具有很好的疗效[1]。目前对板蓝根多糖的提取多采用水煎纯沉工艺,但是该方法对多糖的质量控制并不理想,也给板蓝根多糖的进一步开发利用造成了一定的困难。本文即是对板蓝根多糖提取工艺进行分析,并对其体外免疫增强活性进行考察,现将相关情况报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本组实验选取的板蓝根药材为十字花科植物菘蓝的干燥根,所用仪器包括紫外可见光分光光度计、真空泵、真空干燥箱、电热鼓风干燥箱、电子分析天平、离心机、压力蒸汽灭菌器、旋转蒸发仪和全自动酶标仪;试剂包括硫酸、苯酚、甲醇、乙醇等分析纯,以及自制板蓝根多糖、蒸馏水、胎牛血清、刀豆素、红细胞裂解液;细胞包括淋巴细胞、YAC-1细胞和NK细胞;试验动物为BALB/c小鼠。

1.2 实验方法

1.2.1 测定板蓝根多糖含量

采用显色方法测定板蓝根多糖含量,即在供试液中加入5%苯酚1ml,摇匀后再加入浓硫酸5ml,静置待测;制备对照品和供试品溶液,前者浓度为0.1mg/ml,后者浓度为0.4mg/ml;精密吸取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml和0.8ml置入1比色管中,各加蒸馏水调至2ml,摇匀后再加入5%苯酚1ml和浓硫酸5ml,利用紫外分光光度计测定溶液浓度,分析其线性关系;取供试品溶液进行重复性试验,并分别在0、1、2、3、5h利用紫外分光光度计测定溶液浓度,观察板蓝根多糖显色效果的稳定性;最后采用重量法测定浸膏得率,分析各因素对多糖提取效果的影响[2]。

1.2.2 免疫增强活性实验

①制备淋巴细胞:脱颈处死小鼠,放入75%乙醇中浸泡;剪开小鼠左腹部,取出脾脏进行培养;吸取上层淋巴细胞悬液于试管内,并加入红细胞裂解液5ml,加入培养基;清洗淋巴细胞并计数,称取20mgIIF,溶入5ml蒸馏水中,配成储备液,按照1:1比例与PBS混合,对IIF溶液进行稀释,置于4℃温度下保存待用;称取5mg刀豆素A,置于5mlPBS溶液中,将其作为阳性对照储备液;观察淋巴细胞生长情况,检测其上清液中IL-10和IFN-的含量[3]。②检测IL-10:取不同浓度IIF溶液作为药物组,将加入刀豆素A和淋巴细胞悬液作为阳性对照组,将加入PBS和淋巴细胞悬液作为阴性对照组,吸取三组上清到EP管中,去除聚合物后收集上清;配置标准品,与各组同时置于18～25℃中孵育2h;配置HRP,孵育,检测OD值。③检测IFN-:其方法与IL-10基本一致[4]。

2 结果

多糖含量测定结果显示,葡萄糖在0.1～0.8mg/ml之间的线性关系较好,回归方程计算的供试品中多糖的含量为5mg,为取样量的1/2,采用硫酸-苯酚法显色后,1h前溶液检测结果未发生变化,2h后开始降低,为保证检测结果的准确性,溶液必须在显色后1h内检测;浸膏得率受温度、提取时间和加水量等因素影响,其中,温度越高、提取时间越长,浸膏得率越大,加水量在10倍时,浸膏得率变化较小。根据上述工艺,称取板蓝根药材4kg,得到促多糖为583.8g,得率约为15%。

免疫增强活性实验结果显示,IIF低浓度组与阴性对照组比较,细胞上清液中的IL-10含量得到明显提高,随着药物浓度的不断增高,其含量并未随着增加,在4.5μg/ml时,含量达到最高,表明此过程无明显的浓度依赖性;药物组与阴性对照组相比,细胞上清液中的IFN-I含量并未提高,各组差异并不明显;三组NK细胞活性相比,药物组明显高于阴性对照组,略小于阳性对照组,表明IIF能够提高NK细胞的活性。

3 讨论

本研究采用硫酸-苯酚法测定板蓝根多糖含量,通过线性、重复性和准确度的考察,该方法的可靠性得以证实,并以浸膏得率为指标,通过对温度、提取时间和加水量等因素的考察,建立了多糖提取的最佳工艺条件,即温度为100℃,用水量为10倍,共煎煮2次,每次2.5h。免疫增强活性实验证实,IIF能够提高淋巴细胞分泌IL-10的含量,促进机体的体液免疫应答,从而产生免疫效应,而且其对IFN-I含量的影响并不大。

综上所述,板蓝根多糖具有一定的体液免疫作用,并能够提高NK细胞的活性,增强其对病毒的吞噬能力,能够更好地发挥抗病毒的功效。

[1]何立巍,李祥,王洪兰,等.板蓝根多糖的结构特征及活性研究[J].中国中药杂志,2011,16(5):2179-2182.

[2]李娟.板蓝根多糖的分离纯化及抑制流感病毒神经氨酸酶活性的研究[D].东北师范大学,2013.

[3]朱婷.板蓝根多糖化学结构及佐剂活性的研究[D].中南大学,2013.

[4]陈智,陈凯,田景振.冻融-酶解-膜分离复合技术纯化板蓝根多糖的工艺优选[J].中国实验方剂学杂志,2013,14(5):42-44.