沙门氏菌核酸检测试剂盒的评价

邵碧英，董 建，陈 彬，陈文炳，黄晓蓉，郑 晶，缪婷玉，彭 娟

（福建出入境检验检疫局 福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建 福州　　350 001）

沙门氏菌核酸检测试剂盒的评价

邵碧英，董 建，陈 彬，陈文炳，黄晓蓉，郑 晶*，缪婷玉，彭 娟

（福建出入境检验检疫局 福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建 福州350 001）

采用室内技术参数验证和协同实验的方式对商品化沙门氏菌核酸检测试剂盒在食品中沙门氏菌核酸检测上的包容性、排他性、灵敏度、特异性、准确度、检测限、耐变 性、批间变异进行评价。评价结果表明，试剂盒检测结果与国家标准方法检测结果总体上无显著差异，能满足食品样品的检测要求；但对蔬菜制品的灵敏度较其他食品低，与国家标准方法有显著差异，因此该商品化试剂盒不适用于蔬菜制品中沙门氏菌核酸的检测。

沙门氏菌；核酸检测试剂盒；环介导等温扩增；评价

沙门氏菌是最常见的食源性致病菌，传统的检验方法往往需要花费很长的时间。许多快速、灵敏的分子生物学方法已被应用于食品微生物的快速检验，克服了传统检验方法的缺陷，其中聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）已成为最普遍的食品微生物分子生物学检验方法。近年来，在PCR技术基础上又出现了新的技术，如环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术。LAMP技术具有简便、高效、特异、快速等优点，在食品中过敏原［1-2］、转基因成分［3-5］、致病菌［6-21］的筛选检测上已得到较广泛的应用。市场上也出现了相关的商品化LAMP检测试剂盒，如由广州华峰生物科技有限公司生产的沙门氏菌核酸检测试剂盒就是应用LAMP法检测食品中的沙门氏菌核酸。而这些商品化检测试剂盒是否真正满足日常检测的需求，还需经过实验室评价。本实验室已开展了Easy TestTM菌落总数测试片［22］、3M PetrifilmTM金黄色葡萄球菌检验测试片［23］的评价实验，本实验在此基础上，根据SN/T 2775—2011《商品化食品检测试剂盒评价方法》［24］和SN/T 3256—2012《食品微生物检验方法确认技术规范》［25］的要求，以GB 4789.4—2010《食品微生物学检验：沙门氏菌检验》［26］为参考方法，研究建立了对广州华峰生物科技有限公司生产的沙门氏菌核酸检测试剂盒的评价方案，并进行了评价实验，以评估其在食品检测中的准确性和适用性，为更加准确和规范地使用该商品化试剂盒、进一步制定标准提供一定的参考依据。

1　　材料与方法

1.1材料与试剂

沙门氏菌标准菌株、参照菌株、实验室分离菌株、非沙门氏菌的标准菌株、供试食品样品由本单位微生物实验室保存；沙门氏菌核酸检测试剂盒［批号分别为Sal11121303、Sal12041702（R）、Sal11122202］由广州华峰生物科技有限公司提供，除批间变异用3 个批号外，其他试验均用批号为Sal12041702（R）的试剂盒；GB 4789.4—2010所需培养基和试剂北京陆桥技术有限责任公司。

1.2仪器与设备

Stomacher 3500型拍击式均质器英国Seward公司；BD115型恒温培养箱德国Binder公司；MIKRO120型台式高速离心机德国Hettich公司；2004型水浴锅常州国华电器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌悬液的制备

将沙门氏菌标准菌株、参照菌株、实验室分离菌株，非沙门氏菌的标准菌株分别活化后接种于营养肉汤中，37 ℃培养18～24 h。

1.3.2包容性和排他性的测试

包容性是指确定某一检测方法从众多菌中检测到目标菌的能力，选择100 株沙门氏菌的纯化菌株，用核酸检测试剂盒法进行测试。排他性是指某一检测方法对可能引起交叉反应的相关非目标菌株的抗干扰能力，选择30 株非沙门氏菌的纯化菌株，用核酸检测试剂盒法进行测试。核酸检测试剂盒测试按照说明书进行，呈橘色的即为阴性结果，呈绿色的即为阳性结果。

1.3.3准确度、特异性、灵敏度及检测限的测试

参照文献［25］，选择家禽类、鱼类和海产品、蔬菜制品、乳制品、杂品共5 类15 种代表性食品作为验证基质。将肠炎沙门氏菌（ATCC13076）培养液适当稀释后，分别制备未接种（L0）、低浓度（L1）、高浓度（L2）3 个污染水平实验样品，低浓度（L1）、高浓度（L2）两个水平之间相差10 倍，分别用核酸检测试剂盒和参考方法进行测试，均进行20 个平行。对数据进行统计分析。

相对准确度：相同的样品用核酸检测试剂盒法和参考方法测试结果的一致程度，即LAMP方法和参考资料方法均确证为阳性的数量与均确证为阴性的数量之和除以用于确证的样品总数。

相对特异性：核酸检测试剂盒法和参考方法均确证为阴性的总数除以参考方法确证为阴性的总数。

相对灵敏度：核酸检测试剂盒法和参考方法均确证为阳性的数量除以参考方法确证为阳性的总数。

检出限：当检出概率＞0.5时，25 g基质中的菌含量即为方法的检出限。检出概率为检出阳性结果占所有检测结果的比率，即：检出概率=x/N，式中：x为检出阳性结果次数；N为测定总次数。

1.3.4耐变性的测试

分别取非目标菌（肺炎克雷伯氏菌46117），高浓度、低浓度目标菌（肠炎沙门氏菌ATCC13076）菌悬液，对核酸检测试剂盒法的反应温度（正常设置为65 ℃）和反应时间（正常设置为60 min）2 个变量进行耐变性实验。每个变量取2 个不同的水平，反应温度取65 ℃和60 ℃，反应时间取65 min和55 min。2 个变量进行两两组合，每个组合进行10 个平行。

1.3.5批间变异的测试

取纯培养的1 株目标菌（肠炎沙门氏菌ATCC13076）、1 株非目标菌（肺炎克雷伯氏菌46117）的菌悬液，分别用3 个不同批号的沙门氏菌核酸检测试剂盒进行检测，比较结果，以测试试剂盒的批间变异、稳定性。

1.3.6室间协同实验

以牛乳为基质，添加肠炎沙门氏菌培养液，制备成未接种（L0）、低浓度（L1）、高浓度（L2）3个接种水平的冻干样品，发送8 家实验室进行协同实验。每一接种水平的样品同时用核酸检测试剂盒法和参考方法进行测试，均做8 个平行，比较2 种方法的结果。

2　　结果与分析

2.1包容性和排他性的测试结果

选择100 株经确认的沙门氏菌标准菌株（6 株）、参照菌株（5 株）和实验室分离菌株（89 株），用核酸检测试剂盒进行测试，结果全部为阳性，表明该试剂盒在包容性上表现良好。

选择30 株经确认的非沙门氏菌的标准菌株，用核酸检测试剂盒进行测试，结果全部为阴性，表明该试剂盒在排他性上表现良好。

2.2准确度、特异性、灵敏度及检测限的测试结果测试结果如表1所示，数据分析结果如表2所示。与参考方法相比，该核酸检测试剂盒对家禽食品的相对准确度、相对特异性、相对灵敏度均较好，试剂盒方法检出限为1.12 CFU/g；对鱼类和海产品的相对准确度、相对特异性、相对灵敏度均较好，试剂盒方法检出限为

表1　　15 个食品类型的实验结果Table 1　　Test results for 15 kinds of food samples

表2　相对准确度、特异性、灵敏度及检出限统计分析结果TTaabbllee 22 　　SSttaattiissttiiccaall aannaallyyssiiss ooff rreellaattiivvee aaccccuurraaccyy， ssppeecciiffi i cciittyy，sensitivity and limit of detection

1.12 CFU/g；对蔬菜制品的相对灵敏度较差，试剂盒方法在1.12 CFU/g污染水平不能有效检出；对乳制品的相对准确度、相对特异性、相对灵敏度均较好，试剂盒方法检出限为0.11 CFU/g；对杂品类食品的相对准确度、相对特异性、相对灵敏度均较好，试剂盒方法检出限为

1.12 CFU/g。

2.3耐变性的测试结果核酸检测试剂盒说明书上所用的条件为：65 ℃、

表3　　耐变性测试结果Table 3　　Results of stability test

60 min，分别对反应温度和反应时间2 个变量进行耐变性实验，结果如表3所示。检测结果表明，该试剂盒在反应温度65 ℃、反应时间55 min和反应温度60 ℃、反应时间

65 min的实验条件下操作较为适宜。在65 ℃、65 min的条件下，反应时间超过了说明书规定的时间，就会出现假阳性结果。在60 ℃、55 min的条件下，反应温度低于说明书规定的适宜温度，就会出现假阴性结果。因此超出试剂盒说明书规定的反应温度或反应时间，会出现假阳性或假阴性结果。

2.4批间变异的测试结果

表 4　　批间变异测试结果Table 4　　Results of inter-batch variations

取3 个不同批号的试剂盒对目标菌（肠炎沙门氏菌ATCC13076）和非目标菌（肺炎克雷伯氏菌46117）进行批间变异实验，测试结果如表4所示。结果表明，该试剂盒的批间总体差异较小，但个别出现假阳性和假阴性的结果。

2.5协同实验的测试结果

8 家实验室对3 个接种水平样品的测试结果如表5所示，统计结果如表6所示。结果分析表明2 种方法无显著差异且方法稳定可靠。

表5　　协同实验结果Table 5　　Results of collaboration test

表6　协同实验的统计结果TTaabbllee 66 　　SSttaattiissttiiccaall aannaallyyssiiss ooff ccoollllaabboorraattiioonn tteesstt

3　　结 论

本实验参考SN/T 2775—2011［24］和SN/T 3256—2012［25］

制订的评价实验方案对广州华峰生物科技有限公司生产的沙门氏菌核酸检测试剂盒开展相关技术参数的验证，评价结果表明，试剂盒检测结果与国家标准方法［26］

检测结果总体上比较无显著差异，能满足食品样品的检测要求；但蔬菜制品的灵敏度较其他食品低，与国家标准方法有显著差异，因此不适用于检测蔬菜制品。沙门氏菌LAMP检测方法具有快速、简便、灵敏的特点，无需使用大型仪器设备，适用于食品中沙门氏菌的快速筛查检测，适合在基层实验室推广应用。

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Evaluation of Salmonella Nucleic Acid Detection Kit

SHAO Biying， DONG Jian， CHEN Bin， CHEN Wenbing， HUANG Xiaorong， ZHENG Jing*， MIAO Tingyu， PENG Juan
（Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，Fujian Province Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Fuzhou35000 1， China）

The inclusiveness， exclusivity， sensitivity， specificity， accuracy， limit of detection （LOD）， resistance to denaturation and batch variation of the commercial Salmonella nucleic acid detection kit used to detect Salmonella in food samples were evaluated based on indoor technical parameters by validation and collaboration test. Results showed that the kit was not signifi cantly different from the national standard method in general， and could meet the requirements of food sample testing. However， the sensitivity for vegetables products was lower than those of other foods， which signifi cantly differed from the national standard method. Thus the commercial kit was not suitable for detection of Salmonella in vegetable products.

Salmonella； nucleic acid detection kit； loop-mediated isothermal amplifi cation； evaluation

Q93.33

A

1002-6630（2015）24-0242-04

10.7506/spkx1002-6630-201524045

2015-06-29

福建省科技计划项目（2011Y0002）；国家认监委出入境检验检疫行业标准制（修）订计划项目（2013B264K）作者简介：邵碧英（1973—），女，研究员，博士，研究方向为食品生物学分子检测。E-mail：byshao@sohu.com

郑晶（1973—），女，研究员，硕士，研究方向为食品微生物检验。E-mail：fjciqzj@qq.com